一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白，所述牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列相比SEQ AAB28458.1至少有两个位点被半胱氨酸替代，且替代后的半胱氨酸之间由二硫键连接，在此基础上又进行内二硫键、空穴填充和单链连接等改进，同时提供了此类抗原蛋白的制备方法。该抗原蛋白应用蛋白质晶体学的技术和理论，确定蛋白在病毒侵染和致病过程中的结构变化，再根据结构变化的结果对这个关键的病毒蛋白进行基因工程改造，使其成为只侵染不致病、并引起动物体抗体高效反应的蛋白抗原，能够有效的预防和治疗牛呼吸道胞合体病毒感染，以此为基础可以开发出理想的病毒疫苗，有效控制和防范病毒感染带来的损失，具有重大的经济意义和社会意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物产品制备
，涉及一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白及其制备方法。
技术介绍
牛呼吸道胞合体病毒（BovineRespirationSyncytialVirus–BRSV）感染可引起牛呼吸道疾病，在欧共体国家被列为仅次于牛粘膜病（BVD）及牛传染性鼻气管炎（IBR）的重要牛病之一。本病呈世界范围性流行，其危害性在于BRSV感染发病率高达到60%-80%，死亡率在一些爆发中达到20%以上，给养牛业造成很大的经济损失。虽然这种BRSV从上个世纪70年代就开始列入研发范畴，由于种种原因并没有开发出理想的药物和疫苗。尽管已有关于BRSV的多种灭活，弱毒，重组以及DNA疫苗的报道，但距离临床使用还有一定距离，目前国际上尚没有理想的病毒疫苗。传统疫苗的研制和生产主要是通过改变培养条件，或在不同寄主动物上传代使致病微生物毒性减弱，或通过物理、化学方法将其灭活来完成的。随着人类知识的不断进步，传统疫苗的局限性也日益显露出来：(1)动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养，这使得疫苗生产的成本很高；(2)疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中有可能没有完全杀死或充分减毒，这会导致疫苗中含有强毒性致病物质，进而使得疾病在更大的范围内传播；(3)减毒菌株有可能会发生突变，引起病害。牛呼吸道胞合体病毒是副黏液病毒科家族的成员，其上的F-蛋白是高度保守的并形成三聚体刺突，其在激活下发生构象变化。F-蛋白介导病毒和细胞膜的融合，让病毒核壳体进入细胞质，抑制F-蛋白介导的步骤阻抑感染周期的起始阶段并中和病毒感染性可以有效的防止病毒侵害，即针对F-蛋白的抗体，抑制它的活性，可以中和病毒感染性并可以保护免受BRSV感染。施一公开创了中国结构生物学基础理论研究的先河，本专利技术将结构生物学应用到实际中，合成牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白及其制备方法，该抗原蛋白应用蛋白质晶体学的技术和理论，确定蛋白在病毒侵染和致病过程中的结构变化，再根据结构变化的结果对这个关键的病毒蛋白进行基因工程改造，使其成为只侵染不致病、并引起动物体抗体高效反应的蛋白抗原。为了实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白，编码牛呼吸道胞合体病毒关键蛋白F-蛋白野生种的氨基酸序列简称SEQAAB28458.1，具体序列为MGTTAMRMVISIIFISTYVTHITLCQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVVTIELSKIQKNVCKSTDSKVKLIKQELERYNNAVIELQSLMQNEPASFSRAKRGIPELIHYPRNSTKRFYGLMGKKRKRRFLGFLLGIGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKELLPKVNNHDCRISNIGTVIEFQQKNNRLLEIAREFSVNAGITTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSVVKEEVIAYEVQLPIYGVIDTPCWKIHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTKYDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFPIGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALYIKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLHSVDVGKSTTNVVITTIIIVIVVVILMLIAVGLLFYCKTRSTPIMLGKDQLSGINNLSFSK，其特征在于：所述牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列相比SEQAAB28458.1至少有两个位点被半胱氨酸替代，且替代后的半胱氨酸之间由二硫键连接。作为优化的，所述位点为氨基酸序列第148位缬氨酸和288位异亮氨酸。作为优化的，所述位点为氨基酸序列第158位亮氨酸和290位丝氨酸。作为优化的，所述牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列相比SEQAAB28458.1，在第260位点的亮氨酸由半胱氨酸替代，并在该位点实现空穴填充。作为优化的，所述针对牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列剔除SEQAAB28458.1序列中的103位点至138位点的氨基酸序列，采用sgsgs连接102位点和139位点。作为优化的，所述针对牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列剔除SEQAAB28458.1序列中的103位点至142位点的氨基酸序列，采用sgsgs连接102位点和143位点。作为优化的，所述编码牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列相比SEQAAB28458.1序列，第99位点天冬氨酸由半胱氨酸替代，第362位点丝氨酸由半胱氨酸替代，并在替代后的半胱氨酸之间连接内二硫键。一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的制备方法，其特征在于：具体工艺如下：（1）根据结构生物学的原理，进行蛋白结晶，结晶后用X-射线观测，确定侵染病毒关键病原F-蛋白侵染前后的结构变化；（2）根据步骤（1）结构变化设计出抗原蛋白的序列和结构；（3）经多种抗原测试和稳定性特性检测确定出需要抗原蛋白的合格性；（4）将经过验证的抗原蛋白序列进行相应的蛋白合成、表达、提纯和检测，得到用来作为动物试验和临床试验的针对牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白。牛胞合体病毒关键F-蛋白介导病毒和细胞膜的融合，让病毒核壳体进入细胞。针对牛呼吸道胞合体病毒设计的抗原蛋白，便是根据F-蛋白侵染前后的结构变化设定的，在基因工程的基础上使F-蛋白结构始终保持在融合前的状态，使其具有只侵染不致病、并引起动物体抗体高效反应的蛋白抗原等特点。本专利技术能够使F-蛋白在侵染前后都保持三聚体刺突状态（闭合状态），得到只侵染不致病、并引起动物抗体高效反应的蛋白抗原；为了保证来自于病原病毒上的F-蛋白处在稳定的侵染前的状态，给F-蛋白上增添了系列的连接链，包括内二硫键、二硫键、空穴填充和单链连接。本专利技术与现有技术相比，其有益效果是：采用蛋白质晶体学方法制备的牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白能够有效的预防和治疗牛呼吸道胞合体病毒感染，以此为基础可以开发出理想的病毒疫苗；有效控制和防范病毒感染带来的损失，具有重大的经济意义和社会意义。附图说明图1本专利技术涉及利用Phenix软件进行牛合胞体病毒F-蛋白的三维立体结构模拟图，左图为浸染前三聚体三维立体结构模拟图，右图为左图右下角方框位置的局部放大图。图2本专利技术涉及的牛合胞体病毒呼吸道病毒侵染前后过程的关键的F-蛋白结构变化示意图。在图中显示侵染前（左），F-蛋白三聚体呈现三聚体刺突状态，侵染后（右）F-蛋白被激活，发生构象变化，病毒和细胞膜的融合，病毒核壳体进入细胞质，进而侵染牛体并使其致病。图3本专利技术涉及的经过改造成功的牛呼吸道胞合体蛋白抗原侵染牛体后的电镜照片状态。左图显示RD-BRSV-DB1-CF1改造的牛呼吸道胞合体蛋白抗原侵染牛体后的状态，可见呈现稳定的融合前三聚体刺突状态，右图为未经过改造的牛呼吸道胞合体病毒侵染牛体后的电镜照片。图4本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白，编码牛呼吸道胞合体病毒关键蛋白F‑蛋白野生种的氨基酸序列为简称SEQ AAB28458.1，具体序列为MGTTAMRMVISIIFISTYVTHITLCQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVVTIELSKIQKNVCKSTDSKVKLIKQELERYNNAVIELQSLMQNEPASFSRAKRGIPELIHYPRNSTKRFYGLMGKKRKRRFLGFLLGIGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKELLPKVNNHDCRISNIGTVIEFQQKNNRLLEIAREFSVNAGITTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSVVKEEVIAYEVQLPIYGVIDTPCWKIHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTKYDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFPIGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALYIKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLHSVDVGKSTTNVVITTIIIVIVVVILMLIAVGLLFYCKTRSTPIMLGKDQLSGINNLSFSK，其特征在于：所述牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列相比SEQ AAB28458.1至少有两个位点被半胱氨酸替代，且替代后的半胱氨酸之间由二硫键连接。...

【技术特征摘要】
1.一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白，编码牛呼吸道胞合体病毒关键蛋白F-蛋白野生种的氨基酸序列为简称SEQAAB28458.1，具体序列为MGTTAMRMVISIIFISTYVTHITLCQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVVTIELSKIQKNVCKSTDSKVKLIKQELERYNNAVIELQSLMQNEPASFSRAKRGIPELIHYPRNSTKRFYGLMGKKRKRRFLGFLLGIGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKELLPKVNNHDCRISNIGTVIEFQQKNNRLLEIAREFSVNAGITTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSVVKEEVIAYEVQLPIYGVIDTPCWKIHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTKYDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFPIGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALYIKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLHSVDVGKSTTNVVITTIIIVIVVVILMLIAVGLLFYCKTRSTPIMLGKDQLSGINNLSFSK，其特征在于：所述牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白的氨基酸序列相比SEQAAB28458.1至少有两个位点被半胱氨酸替代，且替代后的半胱氨酸之间由二硫键连接。2.根据权利要求1所述的一种牛呼吸道胞合体病毒抗原蛋白，其特征在于：所述位点为氨基酸序列第148...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤斌，尹毅，姜钧耀，
申请(专利权)人：烟台偌帝生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37