同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒。该试剂盒是基于GeXP系统使用的，包含10种PCR引物对，用于同时鉴别检测禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和副鸡嗜血杆菌，特异性好，灵敏度高，均可检到100拷贝/μl，与病原体分离和血凝抑制实验或血清学实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。本发明专利技术为常见的主要鸡呼吸道病及其病原体的检测提供了简便、高通量的检测试剂盒和检测体系，更符合实际的需要，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒。
技术介绍
H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和传染性鼻炎是严重危害鸡的9种主要呼吸道传染性疾病。主要临床表现为啰音、咳嗽、气喘、伸颈、张口呼吸、甩头和呼吸困难等症状。这些传染病感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状却十分相似，无法鉴别。鉴别诊断这些呼吸道疾病的传统方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐、费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于这些呼吸 道病的检测，并建立了多重PCR检测技术，同时检测几种病原，但需几对引物组合在一起同时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR—般只检测到3重，由于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此，也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限(多在2-4个基因)，使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目的。GeXP 系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国BeckmanCoulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成用于设计引物的 GeXP expression Profiler 软件和用于结果分析的 GenomeLabTM GeXPGeneticAnalysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp以上的相邻扩增片段。GeXP多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增，通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段(DNA SizeStandard, DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。GeXP系统可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能同时鉴别多种病原体的检测方法和检测试剂盒，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多重引物的扩增转化为I对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。目前，还没有基于GeXP系统的同时可检测家禽多种呼吸道传染性疾病病原体的试剂或试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的GeXP快速检测的试剂或试剂盒，含有如下十种PCR弓I物对的十种、任意九种、任意八种、任意七种、任意六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对A，鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的PCR引物对B，鉴定或辅助鉴定H7亚型禽流感病毒的PCR引物对C，鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对D，鉴定或辅助鉴定新城疫病毒的PCR引物对E，鉴定或辅助鉴定传染性支气管炎病毒的PCR引物对F、鉴定或辅助鉴定传染性喉气管炎病毒的PCR引物对G，鉴定或辅助鉴定鸡毒支原体的PCR引物对H，鉴定或辅助鉴定滑液囊支原体的PCR引物对I，鉴定或辅助鉴定副鸡嗜血杆菌的PCR引物对J ;所述PCR引物对A由序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；所述PCR引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链·DNA组成；所述PCR引物对C由序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA组成；所述PCR引物对D由序列表序列7所示的单链DNA和序列表序列8所示的单链DNA组成；所述PCR引物对E由序列表序列9所示的单链DNA和序列表序列10所示的单链DNA组成；所述PCR引物对F由序列表序列11所示的单链DNA和序列表序列12所示的单链DNA组成；所述PCR引物对G由序列表序列13所示的单链DNA和序列表序列14所示的单链DNA组成；所述PCR引物对H由序列表序列15所示的单链DNA和序列表序列16所示的单链DNA组成；所述PCR引物对I由序列表序列17所示的单链DNA和序列表序列18所示的单链DNA组成；所述PCR引物对J由序列表序列19所示的单链DNA和序列表序列20所示的单链DNA组成。在上述试剂或试剂盒中，所述PCR弓丨物对A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔浓度相问。在上述试剂或试剂盒中，所述PCR引物对A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔浓度均分别为ΙΟηΜ。本专利技术所提供的试剂或试剂盒中的引物对可检测的病原体种类分别如下PCR引物对A可检测16种HA亚型禽流感病毒，即Hl—H16亚型的禽流感病毒；PCR引物对B可检测H5亚型禽流感病毒；PCR引物对C可检测H7亚型禽流感病毒；PCR引物对D可检测H9亚型禽流感病毒；PCR引物对E可检测新城疫病毒；PCR引物对F可检测传染性支气管炎病毒；PCR引物对G可检测传染性喉气管炎病毒；PCR引物对H可检测鸡毒支原体；PCR引物对I可检测滑液囊支原体；PCR引物对J可检测副鸡嗜血杆菌；本专利技术所提供的试剂或试剂盒中的引物对可检测的病原体来源分别如下PCR引物对A可检测禽源的禽流感病毒，PCR引物对B可检测禽源的H5亚型禽流感病毒，PCR引物对C可检测禽源的H7亚型禽流感病毒，PCR引物对D可检测禽源的H9亚型禽流感病毒，PCR引物对E可检测禽源的新城疫病毒，PCR引物对F可检测禽源的传染性支气管炎病毒病毒，PCR引物对G可检测禽源的传染性喉气管炎病毒，PCR弓I物对H可检测鸡、火鸡源鸡毒支原体；PCR引物对I可检测鸡、火鸡源的滑液囊支原体，PCR引物对J可检测禽源的副鸡嗜血杆菌，所述禽源具体可为鸡源或鸭源，但不限于上述病毒的上述来源。本专利技术保护如下引物对A-J在制备鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的试剂 盒中的应用；所述PCR引物对A由序列表序列I所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；所述PCR引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成；所述PCR引物对C由序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA组成；所述PCR引物对D由序列表序列7所本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的GeXP快速检测的试剂或试剂盒，含有如下十种PCR引物对中的十种、任意九种、任意八种、任意七种、任意六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任意一种：鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对A，鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的PCR引物对B，鉴定或辅助鉴定H7亚型禽流感病毒的PCR引物对C，鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对D，鉴定或辅助鉴定新城疫病毒的PCR引物对E，鉴定或辅助鉴定传染性支气管炎病毒的PCR引物对F、鉴定或辅助鉴定传染性喉气管炎病毒的PCR引物对G，鉴定或辅助鉴定鸡毒支原体的PCR引物对H，鉴定或辅助鉴定滑液囊支原体的PCR引物对I，鉴定或辅助鉴定副鸡嗜血杆菌的PCR引物对J；所述PCR引物对A由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；所述PCR引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成；所述PCR引物对C由序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA组成；所述PCR引物对D由序列表序列7所示的单链DNA和序列表序列8所示的单链DNA组成；所述PCR引物对E由序列表序列9所示的单链DNA和序列表序列10所示的单链DNA组成；所述PCR引物对F由序列表序列11所示的单链DNA和序列表序列12所示的单链DNA组成；所述PCR引物对G由序列表序列13所示的单链DNA和序列表序列14所示的单链DNA组成；所述PCR引物对H由序列表序列15所示的单链DNA和序列表序列16所示的单链DNA组成；所述PCR引物对I由序列表序列17所示的单链DNA和序列表序列18所示的单链DNA组成；所述PCR引物对J由序列表序列19所示的单链DNA和序列表序列20所示的单链DNA组成。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，罗思思，谢丽基，邓显文，谢志勤，庞耀珊，刘加波，范晴，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：