本发明专利技术公开了一种用于检测鸽疱疹病毒的引物对，如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列。本发明专利技术还公开了一种包含上述引物对的鸽疱疹病毒的检测试剂盒。由于本发明专利技术采用的引物来自鸽疱疹病毒不同基因中高度保守的区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有鸽疱疹病毒，灵敏度达0.04μL的模板DNA；本研究针对鸽疱疹病毒不同基因中高度保守的区域设计引物，建立一种PCR检测鸽疱疹病毒的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测鸽疱疹病毒的方法，填补了国内空白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种鸽疱疹病毒的检测试剂盒。
技术介绍
疱疫病毒(Herpesviruses)是群中等小的双股DNA病毒,有100以上成员，根据其理化性质分α、β、Y三个亚科α疱疹病毒(如单纯疱疹病毒、水痘一带状疱疹病毒)增殖速度快，引起细胞病变。β疱疹病毒(如巨细胞病毒)，生长周期长，感染细胞形成巨细胞。Y疱疹病毒(如EB病毒)，感染的靶细胞是淋巴样细胞，可引起淋巴增生。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。鸽疱疹病毒感染是由I型鸽疱疹病毒(PiHV)引起的以幼鸽为主的一种病毒性传染病，临床上以鼻炎、结膜炎为特征。感染鸽子也会出现精神沉郁、食欲下降、腹泻、呕吐、神经症状。鸽疱疹病毒于1945年由SMADEL首次报道，自1967年以来，英国、前捷克斯洛伐克、澳大利亚、比利时、匈牙利、德国、法国和意大利已分离 到该病毒，在美国也发现了本病毒。欧洲的大多数鸽子都受到了感染，50%以上的鸽子有特异性抗体，比利时的60%鸽舍内有此病毒存在，饲养的鸽子患有呼吸性疾病，能够从82%患有急性鼻炎鸽子的咽内分离出鸽疱疹病毒。参考文献蒋文明，侯广宇，李金平，陈杰，刘朔，陈继明.鸽疱疹病毒与腺病毒感染的PCR检测方法的建立·山东青岛，动物医学进展，2009，30(8) :63-65.蒋文明，侯广宇，李金平，陈杰，刘朔，陈继明.双重PCR方法检测鹦鹉疱疹病毒和腺病毒感染.山东青岛，中国动物检疫，2009，26 (8): 36— 37.
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鸽疱疹病毒的检测引物。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述鸽疱疹病毒的检测试剂盒，以快速、准确的检测出鸽疱疹病毒，及时隔离受病鸽，避免传染。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种用于检测鸽疱疹病毒的引物对，如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。一种鸽疱疹病毒检测试剂盒，包含上述的引物对。一种鸽疱疹病毒检测试剂盒，包括(I)鸽疱疹病毒阳性和阴性对照；(2)鸽疱疹病毒特异性引物对上游引物Pl :如SEQ ID NO 1所示；下游引物P2 :如SEQ ID NO 2所示；(3)DNA提取试剂采用南京博尔迪生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒；(4)PCR反应试剂2xTaq Master Mix 12. 5 μ L，上下游引物P1、P2 各 I μ L，超纯水8. 5 μ L ；(5)电泳检测试剂由50 X TAE电泳缓冲液20mL，GoldView 100 μ L组成。采用上述试剂盒的检测方法，包括如下步骤(I) DNA 的提取米用 DNA 提取试剂盒(Viral nucleic acid extraction kitII)，根据说明书提取病毒的DNA ；(2) PCR 扩增25“1^体系2父？0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6. 5 yL;上游引物 Pl I μ L ;下游引物Ρ2 I μ L和模板2 μ L ;·PCR 反应条件-MV 5min, 94。。30s，60。。30s, 72°C 30s, 40 个循环；72°C 5min ；4°C保存。( 3 )琼脂糖凝胶电泳将O. 4g琼脂糖和20mL TAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoIdView6. O μ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8 μ L点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳Ih ；(4)判断结果如果扩增出一条250bp特异性片段，则表明待检组织鸽疱疹病毒阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织鸽疱疹病毒阴性。有益效果由于本专利技术采用的引物来自鸽疱疹病毒不同基因中高度保守的区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有鸽疱疹病毒，灵敏度达O. 04 μ L的模板DNA ;本研究针对鸽疱疹病毒不同基因中高度保守的区域设计引物，建立一种PCR检测鸽疱疹病毒的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测鸽疱疹病毒的方法，填补了国内空白。附图说明图 I =PiHV 的 PCR 检测结果。其中，M Bio Marker III，2-6 PCR product。图2 :不同的退火温度。其中，M.Marker :DL5000，1_54°C，2_56°C，3_58°C，4_60°C，5-62。。，6.64。。。图 3:特异性鉴定。其中，M.Bio Marker III，1、2、3_TTV，4、5_FADV，6、7、8_PiHV。图 4:敏感性试验。其中，M. Bio Marker III，1-1: 1，2-1: 2，3-1:4，4-1:8，5-1:16，6-1:32，7-1:64，8-1:128，9-1:256，10-1:512。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例I :试剂盒的制备。I、病料。从浙江、江苏、安徽、山东、上海、福建六个鸽场采取病鸽的135份血清；鸽圆环病毒(PiCV)阳性病料、鸽腺病毒(FADV)阳性病料，由金陵科技学院预防兽医学教研室保存。2、试剂。DNA提取试剂盒(Viral nucleic acid extraction kit II ) ；2xTaq Master Mix,南京博尔迪生物科技有限公司生产Aoldview核酸染料，赛百盛公司生产；琼脂糖，北京拜尔迪生物科技有限公司；10xTBE ;Marker，南京博尔迪生物科技有限公司 3、引物的设计和合成。根据已发表的疱疫病毒的基因序列，利用primer premier 5. O设计引物，由上海英俊公司合成。预期大小约为250bp。上游引物(PiHVI) 5/ -CTTGCGTCCCGGCGATGACT-3'下游引物(PiHV2)5/ -GAGCAGACCGTTGACCACCC-3'4、试剂盒中其他成分的制造。4. I DNA提取试剂购自Geneaid公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(ViralNucleic AcidExtraction Kit II)。4. 2超纯水(ddH20)的制备。购自Takara 公司，ImL/ 管。4. 3 2XPCP master Mix 的制备。购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。4. 4 50XTAE电泳缓冲液的制备。O. 5mol/L乙铵四乙酸二钠((EDTA)溶液(ρΗ8· O)配制EDTA18.61 g 灭菌双蒸水80mLM氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水加至lOOmL。50 X T AE电泳缓冲液配制 三羟1P基氨基甲烷(Tris)242g 冰乙酸57. ImL 0.5mo I/L EDTA 溶液(pH8.0)IOOmL灭菌双蒸水加至IOOOmL。使用时灭菌双蒸水稀释50倍。4. 5 Glodview核酸染料的制备。购自上海赛百盛基因技术有限公司，ImL/管。4. 6上样缓冲液的制备。购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。4.7引物的制备。引物由上海英俊合成，20D/管。实施例2 :检测方法。主要仪器如下PCR仪，圣恩国际有限公司制造；电本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测鸽疱疹病毒的引物对，其特征在于如SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：薛媚，张志成，戴鼎震，
申请(专利权)人：金陵科技学院，
类型：发明
国别省市：
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