李坏死环斑病毒LAMP引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了李坏死环斑病毒LAMP引物、试剂盒及检测方法，其中所述引物包括：正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，和反向内引物BIP。本发明专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种李坏死环斑病毒LAMP引物；本发明专利技术的另一个目的是提供一种包含上述引物的试剂盒；本发明专利技术的另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测李坏死环斑病毒的方法，该检测方法具有：引物特异性强，设备简单，快速、检测灵敏度高、闭管检测、操作简单、结果直接可以判读等特点。

Li necrotic ring spot virus LAMP primer, kit and detection method

The invention discloses a LAMP primer, a kit and a detection method for Li necrotic ring spot virus, wherein the primer comprises a forward outer primer F3, a reverse outer primer B3, a forward internal primer FIP, and a reverse internal primer BIP. The purpose of the invention is to overcome the deficiencies in the existing technology, provide a kind of Prunus necrotic ringspot virus LAMP primer; another object of the invention is to provide a kit containing the primer; another object of the invention is to provide a method of using the kit for detection of Prunus necrotic ring spot virus, with the detection method: primer specificity, the equipment is simple, rapid, high sensitivity, simple operation, closed tube detection, the results can direct interpretation.

【技术实现步骤摘要】
李坏死环斑病毒LAMP引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种李坏死环斑病毒LAMP引物、本专利技术还涉及一种包括上述引物的试剂盒；本专利技术还涉及一种采用上述试剂盒检测李坏死环斑病毒的方法。
技术介绍
李坏死环斑病毒Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV是我国进境检疫性有害生物,国内已有局部发生。该病毒属于雀麦花叶病毒科Bromoviridae、等轴不稳环斑病毒属Ilarvirus,病毒粒子为等轴对称二十面体，不包膜，为三分体基因组，三分子线形正义单链RNA，外壳蛋白质由一种多肽组成，分子量为25KD。该病毒在温带广泛分布,在自然和试验条件下,病毒可侵染31科单子叶植物盒双子叶植物包括李属植物如桃、油桃、樱桃、李、杏、樱花以及其他属的植物如月季、苹果和啤酒花果等,一般可造成30％～70％产量损失，病毒易机械传播。在李属许多种上引起坏死环斑,在欧洲酸樱桃上引起严重症状,引起甜樱桃皱花叶、杏及玫瑰花叶病，对果树种植尤其是核果类果树栽培是一个严重的威胁。李属坏死环斑病毒虽然可以侵染一些草本植物如黄瓜、烟草等,但由于其病毒粒子很不稳定,在未稀释的植物病汁液中侵染活性只有几分钟的时间,接种成功率非常低,且病毒粒子不易提纯。该病毒可以侵染酶联免疫吸附分析方法ELISA是检测该病毒的常规方法,但是由于该病毒稳定性差、难以提纯,致使一直难以制备其大量高效价的抗血清,严重影响了我国对该病毒的检疫检测和监测。传统的植物病毒抗血清制备以提纯的病毒粒子直接免疫动物,需要的抗原用量较大,得到的抗血清中常含有寄主蛋白的抗体,容易导致假阳性反应，因此迫切需要研究新的灵敏度高特异性强的检测方法。目前植物病毒的检测方法主要有生物学、血清学和分子生物学三种，生物学方法就是用病毒指示植物来检测病毒的存在与否，一般需要7-10天；血清学方法是根据抗原抗体的特异性结合来检测病毒，一般只需要4-6小时左右，但是它需要特异性的抗血清，而且检测灵敏度不高，还存在有非特异性问题；分子生物学方法主要是指PCR方法，该方法快且准确性也比较高，但是需要昂贵的检测仪器和相关设备，而且对于像PNRSV这个病毒，由于其带毒率非常低，故需要灵敏度非常高的检测方法才能将潜在的PNRSV检测出来，以上三种方法灵敏度都难以达到，这样必将存在漏检的可能，所以急需研究新的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种李坏死环斑病毒LAMP引物；本专利技术的另一个目的是提供一种包含上述引物的试剂盒；本专利技术的另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测李坏死环斑病毒的方法，该检测方法具有：引物特异性强，设备简单，快速、检测灵敏度高、闭管检测、操作简单、结果直接可以判读等特点。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：一种李坏死环斑病毒LAMP引物，其特征在于包括：正向外引物F3：5’TGCCGTTCTTGCAAGAAGTG3’；反向外引物B3：5’TCTCGGTGATTGTGTGCTAC3’；正向内引物FIP：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT-CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT3’；F2：5’CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；反向内引物BIP：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA-GAATTCGGGGAGGCACATT3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA3’；B2:5’GAATTCGGGGAGGCACATT3’。本专利技术一种李坏死环斑病毒LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：其中所述引物包括：正向外引物F3：5’TGCCGTTCTTGCAAGAAGTG3’；反向外引物B3：5’TCTCGGTGATTGTGTGCTAC3’；正向内引物FIP：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT-CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT3’；F2：5’CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；反向内引物BIP：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA-GAATTCGGGGAGGCACATT3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA3’；B2:5’GAATTCGGGGAGGCACATT3’；其中该试剂盒的产品规格：40次。如上所述的李坏死环斑病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：如上所述的李坏死环斑病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。本专利技术一种李坏死环斑病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品DNA；B、建立LAMP反应体系：按检测所需的反应量从权利要求2所述的试剂盒中分别取各种试剂，放入灭菌试管中，在冰上配制预混液；轻弹击灭菌试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在灭菌试管底部；20μLLAMP反应体包括：C、加样：在三个装有20μLLAMP反应体的灭菌试管中分别加入待检测的待检测样品RNA、阴性对照反应样品、阳性对照反应样品各5μL，使各自的总量达到25μL，盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在灭菌试管底部；其中阴性对照反应使用去离子水作为样品，阳性对照反应使用带有PNRSVRNA的阳性对照，D、扩增：将步骤C中的灭菌试管放置在恒温器中，在60-65℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；E、检测：使用紫外线照射装置从灭菌试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。如上所述的李坏死环斑病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品RNA，具体按以下步骤提取：a1、取0.1g的CMV和TMV感病组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；a2、清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；a3、结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；a4、清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；a5、裂解：加入50μLddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；a6、取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为PNRSV和PPV的RNA。如上所述的李坏死环斑病毒LAMP检测方法，其特征在于步骤E中紫外线照射装置的紫外线范围：波长240－260nm或350-370nm。如上所述的李坏死环斑病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物中外引物与内引物的比例为l:2-1:10。如上所述的李坏死环斑病毒LAMP检测方法，其特征在于所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向内引物FIP、0.2μl反向内引物BIP。如上所述的李坏死环斑病毒LAMP检测方法，其特征本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种李坏死环斑病毒LAMP引物，其特征在于包括：正向外引物F3：5’TGCCGTTCTTGCAAGAAGTG3’；反向外引物B3：5’TCTCGGTGATTGTGTGCTAC3’；正向内引物FIP：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT‑CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT3’；F2：5’CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；反向内引物BIP：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA‑GAATTCGGGGAGGCACATT3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA3’；B2:5’GAATTCGGGGAGGCACATT3’。

【技术特征摘要】
1.一种李坏死环斑病毒LAMP引物，其特征在于包括：正向外引物F3：5’TGCCGTTCTTGCAAGAAGTG3’；反向外引物B3：5’TCTCGGTGATTGTGTGCTAC3’；正向内引物FIP：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT-CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT3’；F2：5’CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；反向内引物BIP：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA-GAATTCGGGGAGGCACATT3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA3’；B2:5’GAATTCGGGGAGGCACATT3’。2.一种李坏死环斑病毒LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：其中所述引物包括：正向外引物F3：5’TGCCGTTCTTGCAAGAAGTG3’；反向外引物B3：5’TCTCGGTGATTGTGTGCTAC3’；正向内引物FIP：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT-CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2：F1c：5’CGAAGCCCTATTCGGGCTTCT3’；F2：5’CATCCGAATGGAGCTCTGG3’；反向内引物BIP：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA-GAATTCGGGGAGGCACATT3’；其中所述反向内引物BIP包括含B1c和B2：其中B1c：5’ACCACAGCCGGTCGTGAAGA3’；B2:5’GAATTCGGGGAGGCACATT3’；其中该试剂盒的产品规格：40次。3.根据权利要求2所述的李坏死环斑病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应液缓冲液由以下组分组成：4.根据权利要求2所述的李坏死环斑病毒LAMP试剂盒，其特征在于所述荧光染料为钙黄绿素；所述酶溶液为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。5.一种李坏死环斑病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品RNA；B、建立LAMP反应体系：按检测所需的反应量从权利要求2所述的试剂盒中分别取各种...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈定虎，管维，
申请(专利权)人：陈定虎，
类型：发明
国别省市：广东,44