本发明专利技术公开一种检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒，有用于PCR反应的上游引物和下游引物，其特征在于：所述上游引物序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物序列如SEQIDNO.2所示，所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQIDNO.3所示序列。使用本发明专利技术试剂盒对太平洋鳕神经坏死病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测线性范围广等优点。本发明专利技术试剂盒可应用于太平洋鳕人工养殖中，从选择不携带病毒的亲鱼开始选育，并对精子、卵子、受精卵及仔稚鱼进行实时监测，以确保亲鱼、精子、卵子、受精卵和仔稚鱼体内携带的病毒量处于低水平，避免因病毒爆发而导致鱼苗大量死亡，从而克服了太平洋鳕人工繁育的瓶颈。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测鱼类病毒用试剂盒，尤其是一种检测太平洋鳕亲鱼与仔稚鱼神经坏死病毒用试剂盒。
技术介绍
太平洋鳕是我国北方重要的海水经济鱼类，目前由于过度捕捞以及环境的影响，中国近海水域的太平洋鳕数量不断减少。为此，人们对太平洋鳕进行了人工养殖，但是其在仔稚鱼期就会出现短期大量死亡现象。虽然已有研究表明，鱼类发育初期主要依赖于非特异免疫（包括母源抗体）的保护，若特异免疫系统发育较晚，仔稚鱼的免疫力可能在一段时间内相对薄弱，不能满足鱼体的需求，导致了鱼体自身携带病毒的爆发，以至于鱼苗大量死亡。但是，迄今为止，对于太平洋鳕还没有关于自身携带病毒以及检测试剂盒的相关报道，鱼苗大量死亡成为制约太平洋鳕人工育苗的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种利用绝对荧光定量PCR（FQ-PCR）方法检测太平洋鳕亲鱼与仔稚鱼神经坏死病毒用试剂盒。 本专利技术的技术解决方案是：一种检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒，有用于PCR反应的上游引物和下游引物以及神经坏死病毒基因的质粒标准品，其特征在于：所述上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQ ID NO.3所示序列。 本专利技术发现了制约太平洋鳕人工繁育的关键病原（即神经坏死病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示），并建立了检测该病毒的试剂盒。使用本专利技术试剂盒对太平洋鳕神经坏死病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测线性范围广等优点。本专利技术试剂盒可应用于太平洋鳕人工养殖中，从选择不携带病毒的亲鱼开始选育，并对精子、卵子、受精卵及仔稚鱼进行实时监测，以确保亲鱼、精子、卵子、受精卵和仔稚鱼体内携带的病毒量处于低水平，避免因病毒爆发而导致鱼苗大量死亡，从而克服了太平洋鳕人工繁育的瓶颈。 附图说明 图1本专利技术实施例所用特异性引物扩增的熔解曲线。 图2本专利技术实施例病毒基因PCR产物重组质粒1.2% 的琼脂糖凝胶电泳图。 图3是本专利技术实施例扩增质粒标准品的定量限和灵敏度检测结果示意图。 图4本专利技术实施例根据标准品（102×、103×、104×、105×、106×）荧光定量PCR结果建立的标准曲线图。 图5本专利技术实施例太平洋鳕组织PCR产物1.2% 的琼脂糖凝胶电泳图。 具体实施方式 1.太平洋鳕神经坏死病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 2.建立了检测太平洋鳕神经坏死病毒的绝对荧光定量PCR试剂盒，有上游引物、下游引物、qPCR SuperMix及ddH2O，所述上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQ ID NO.3所示序列。 20 μl 反应体系如下： 模板 1 μl 上游引物 1 μl 下游引物 1 μl 含SYBR的聚合酶链式反应液 10 μl ddH2O 7 μl 反应程序： 50℃ 2min；95℃ 10min； 95℃ 30s, 60℃ 1min，40个循环。 本专利技术所用特异性引物扩增的熔解曲线如图1所示，横坐标为退火温度，纵坐标为荧光值。 神经坏死病毒基因的质粒标准品按如下方法获得： 取具有神经坏死病毒症状（幼鱼游泳状态异常，呈螺旋或转圈游泳，且经常漂浮在水面）的太平洋鳕幼鱼头部提取总RNA，利用反转录试剂盒进行反转录反应合成cDNA,以本专利技术试剂盒的引物进行绝对荧光定量PCR，获得病毒基因PCR产物；将所得到病毒基因PCR产物与pMD18-T载体（由大连宝生物公司提供）连接获得该基因重组的载体，转化大肠杆菌，取1μL菌液经载体特异引物M13（由大连宝生物公司提供）筛选阳性克隆菌株，用于1.2% 的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，表明我们获得了含有目的基因的克隆菌株。通过质粒提取试剂盒（由上海生物工程有限公司提供）获得含有该病毒基因的质粒，作为标准品母液。 以对成年太平洋鳕（未知样品）的具体检测步骤如下： 1．建立标准曲线 将标准品母液倍倍稀释（101×、102×、103×、104×、105×）作为绝对定量的质粒标准品。标准品浓度是在微量核酸浓度测定仪中测定，1μl的质粒标准品含有病毒的拷贝数通过如下公式获得：基因拷贝数 = (1 * 6.022x1023) / (length * 1x109 * 650)，length指插入片段的长度。 用本专利技术试剂盒对不同浓度的标准品进行绝对荧光定量PCR反应，扩增质粒标准品的定量限和灵敏度检测结果如图3所示。根据标准（102×、103×、104×、105×、106×）荧光定量PCR结果建立的标准曲线如图4所示，横坐标为拷贝数的Ig值，纵坐标为Ct值。 2.RNA提取： 取成年太平洋鳕的脑、头肾组织，9日龄幼鱼及17日龄幼鱼组织为样品，样品50~100 mg，加入1000 μl trizol，用研磨杵将组织彻底研磨，室温孵育15min，使样品裂解至透明，按现有技术的方法提取RNA。 3. 利用反转录试剂盒进行反转录反应合成cDNA。 4. 以所获得的太平洋鳕cDNA为模板，以本专利技术的试剂盒采用ABI系列荧光定量PCR仪（ABI7500）进行荧光定量PCR反应； 对所得成鱼脑和头肾组织荧光定量PCR产物用于1.2% 的琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，表明引物效率高，荧光定量程序可靠。 5. 用测得的未知样品的Ct值，计算得出未知样品的拷贝数的对数值，从而计算得出未知样品的拷贝数。如 成鱼脑组织Ct值29.04，对数值1.85，拷贝数70.94； 成鱼头肾组织Ct值30.58，对数值0.69，拷贝数4.93。 9日龄幼鱼Ct值30.82，对数值1.32，拷贝数20.67； 17日龄幼鱼Ct值27.31，对数值2.37，拷贝数235.49。 照上述方法检测亲鱼的性腺，筛选不携带病毒的亲鱼作为育种的亲本。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒，有用于PCR反应的上游引物和下游引物以及神经坏死病毒基因的质粒标准品，其特征在于：所述上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQ ID NO.3所示序列。
【技术特征摘要】
1.一种检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒，有用于PCR反应的上游引物和下游引物以及神经坏死病毒基因的质粒标准品，其特征在于：所述上游引物序列如SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛明光，姜志强，蒋洁兰，温施慧，李幸，
申请(专利权)人：大连海洋大学，毛明光，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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