一种利用表达GM‑CSF的腺病毒提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及微生物及生物技术领域，尤其涉及一种利用表达粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子的腺病毒提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法及试剂盒。本发明专利技术方法包括将表达GM‑CSF的重组腺病毒和新城疫灭活疫苗混匀得到疫苗免疫佐剂混合物，然后利用上述疫苗免疫佐剂混合物对禽类进行免疫接种。本发明专利技术还包括一种表达GM‑CSF的重组腺病毒构成的免疫佐剂和一种表达GM‑CSF的重组腺病毒和新城疫灭活疫苗组成的试剂盒，上述方法和试剂盒可用于禽类养殖业。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物及生物
，尤其涉及一种利用表达GM-CSF的腺病毒提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法及试剂盒。
技术介绍
新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起鸡、火鸡、鸽等禽类的一种急性、高度接触传染性疫病，主要通过引起禽类败血症而导致其死亡，是危害养禽养鸡业的三大传染病之一，多年来此疫病已在亚洲很多国家与地区造成了巨大的危害。目前应对新城疫最有效的方式就是注射新城疫灭活疫苗，可有效预防禽类新城疫疫病的发生和传播。免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂，是一种本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能有效增强免疫原性或改变免疫反应类型的非特异性免疫增强剂。免疫佐剂种类很多，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝、磷酸钙、明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、大肠杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷、脂质体、表面活性剂等；油剂，如弗氏佐剂(Freund adjuvant)、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂目前在实验动物中最常用，又可分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种，不完全佐剂可用于免疫注射，完全佐剂的免疫强度大于不完全佐剂，主要用于动物实验，不适宜于人类使用，而且动物多次注射后也常会发生佐剂病。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)是一种多功能生长因子，研究表明，GM-CSF可以刺激造血祖细胞增殖、分化和成熟并从骨髓向外周转移，可以诱导多种细胞分化、增殖。集落细胞刺激因子也常被用作免疫佐剂，其免疫增强效果已被很多研究证实，其作为新城疫灭活疫苗的免疫佐剂使用时，接种到家禽体内能够增加抗原的体积，易被抗原提呈细胞(APC)摄取，延长抗原在体内的存留期，增加与免疫细胞接触的机遇，有利于刺激免疫细胞的增殖。然而，通常将GM-CSF作为免疫佐剂使用时，会采用真核或原核表达系统作为递呈载体，其缺陷是往往会因为GM-CSF的半衰期短而无法很好的发挥免疫佐剂的作用，极大地影响了其免疫增强效果。本专利技术经过多次尝试，最终选择了腺病毒作为GM-CSF的递呈载体，充分利用腺病毒稳定性好、可长时间保存感染力的优势，克服了GM-CSF半衰期短的弊端，提升 GM-CSF的免疫增强效果，进一步提高了GM-CSF作为免疫佐剂增强新城疫灭活疫苗免疫活性的使用有效率。本专利技术所提供的这种通过改善免疫佐剂递呈载体进而提高该佐剂对新城疫灭活疫苗免疫增强效果的方法目前还未有人报道。本专利技术的方法及其试剂盒可广泛适用于禽类免疫产业，本专利技术技术的推广应用将会具有良好的市场前景并产生可观的经济及社会效益。
技术实现思路
解决的技术问题本专利技术需要解决的问题是：本专利技术的目的是克服将GM-CSF作为免疫佐剂使用时，采用真核或原核表达系统作为递呈载体所导致的因为GM-CSF的半衰期短而无法很好发挥免疫佐剂的作用，并极大影响其免疫增强效果的技术问题。技术方案本专利技术旨在提供一种利用表达GM-CSF的腺病毒提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法，以解决目前存在的将GM-CSF作为免疫佐剂使用时，采用真核或原核表达系统作为递呈载体所导致的因为GM-CSF的半衰期短而无法很好发挥免疫佐剂的作用，并极大影响其免疫增强效果的技术难题。本专利技术提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法，包括以下步骤：(1)将表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒和新城疫灭活疫苗混匀得到疫苗免疫佐剂混合物；(2)利用上述疫苗免疫佐剂混合物对禽类进行免疫接种。作为一种优选方案，该方法中所述的表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒为表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的人五型重组腺病毒。进一步地，利用上述方法对禽类进行免疫接种时采用胸部肌肉注射方式。此外，本专利技术还提供了一种用于提高新城疫灭活疫苗免疫效果的免疫佐剂，该免疫佐剂是表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒。作为一种优选方案，该免疫佐剂是表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的人五型重组腺病毒。此外，本专利技术还提供了一种根据上述提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法制成的试剂盒，该试剂盒中包括表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒和新城疫灭活疫苗。作为一种优选方案，该试剂盒中包括表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的人五型重组腺 病毒和新城疫灭活疫苗。进一步地，本专利技术试剂盒可广泛应用于禽类养殖业中。有益效果本专利技术所提供的这种通过改善免疫佐剂递呈载体进而提高该佐剂对新城疫灭活疫苗免疫增强效果的方法克服了现有技术存在的严重缺陷，并为改善免疫佐剂的免疫增强作用提供了简便易行的技术方案。本专利技术经过多次尝试，最终选择了腺病毒作为GM-CSF的递呈载体，充分利用腺病毒稳定性好、可长时间保存感染力的优势，克服了GM-CSF半衰期短的弊端，提升GM-CSF的免疫增强效果，进一步提高了GM-CSF作为免疫佐剂增强新城疫灭活疫苗免疫活性的使用有效率。本专利技术的方法及其试剂盒可广泛适用于禽类免疫产业，本专利技术技术的推广应用将会具有良好的市场前景并产生可观的经济及社会效益。附图说明图1为免疫后新城疫抗体变化。在7、14、21和28天采血分离血清，用血凝抑制试验(HI)检测抗体滴度，用HI的log2值来比较抗体差异，当p≤0.05，差异显著(*)。图2为加强免疫后免疫相关分子表达变化。以28s做内参，所有组和无攻毒对照组比较，当p≤0.05，差异显著(*)。图3为攻毒后临床症状评价和存活率统计。Daily clinical index：临床得分指数；percent survival：存活率；Days post infection(DPI)：感染后天数。图4为组织和眼观病理变化观察。A：前胃显微镜病变(H.E染色，10×40)；B：肺显微镜病变(他染色，10×40)；C：十二指肠病变观察。图5为组织病毒载量检测。在感染后5d采集感染鸡的心脏(heart)、肺脏(lung)、胃(stomach)、十二指肠(Duodenum)和法氏囊(Bursa fabricii)，用实时定量PCR检测病毒滴度，当p≤0.05，差异显著(*)。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法，包括以下步骤：(1)将表达粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒和新城疫灭活疫苗混匀得到疫苗免疫佐剂混合物；(2)利用上述疫苗免疫佐剂混合物对禽类进行免疫接种。

【技术特征摘要】
1.一种提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法，包括以下步骤：(1)将表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒和新城疫灭活疫苗混匀得到疫苗免疫佐剂混合物；(2)利用上述疫苗免疫佐剂混合物对禽类进行免疫接种。2.如权利要求1所述的提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法，其特征在于：所述表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒为表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的人五型重组腺病毒。3.如权利要求1或2所述的提高新城疫灭活疫苗免疫效果的方法，其特征在于：利用所述疫苗免疫佐剂混合物对禽类进行免疫接种时采用胸部肌肉注射方式。4.一种用于提高新城疫灭活疫苗免疫效果的免疫佐剂，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兴龙，杨增岐，王相伟，王重阳，
申请(专利权)人：王兴龙，
类型：发明
国别省市：陕西;61