一种同步检测4种辣椒病毒的多重PCR方法技术

本发明专利技术属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，公开了一种同步检测4种辣椒病毒的多重PCR方法，该PCR体系中含有4对特异性引物(SEQ ID NO1～8)，在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增，得到了1406bp,1202bp,600bp和376bp的特异性条带，建立并优化了能同步检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV的多重RT‑PCR反应体系。检测结果表明优化后的多重RT‑PCR反应体系能对田间样品进行快速、高效地、准确的检测。对监测辣椒上PVY等4种常见病毒病在田间的发生情况以及病害流行预测具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种同步检测4种辣椒病毒的多重PCR方法
本专利技术属于农作物病害诊断和分子生物学
，特别是涉及一种反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的体系及其应用，该体系可用于同步检测4种侵染辣椒的RNA病毒，达到准确、快速、高效检测的目的。
技术介绍
辣椒(Capsicumspp.)是茄科辣椒属植物，因其果实风味独特和营养丰富而成为人们喜爱的蔬菜和调味品，还用于食品色素、医药及工业组分的提取，因此在美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲等地区广为种植，随着辣椒需求量和贸易量的加大，有进一步扩大的趋势。我国辣椒种植面积133万hm2，经济总产值700亿元，均居世界首位，辣椒还是贵州、云南、四川、重庆等省份贫困山区农民的主要经济来源。病毒病是辣椒上一类重要病害，自上世纪70年代以来，随着种植面积的不断扩大、种植区气候和耕作制度的变化，病毒病的发生呈现逐年上升趋势，侵染后常常造成落花、落叶、落果，减产可达30％-70％，甚至绝收，已成为影响辣椒产量和品质的重要限制因素之一。目前，在世界范围内可侵染辣椒的病毒病原有49种之多，其中约15个大类的20种病毒能引起严重症状,在我国约有23种能引起病害症状的辣椒病毒病原。常见有黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、辣椒脉斑驳病毒(Chilliveinalmottlevirus，ChiVMV)、辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus,PMMoV)、番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broadbeanwiltvirus2,BBWV2)、烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)、辣椒内源RNA病毒(Bellpepperendornavirus，BPEV)等。辣椒植株受病毒侵染后表现不同的症状，常见的有花叶、黄化、斑驳、皱缩、畸形、坏死、植株矮化等。但在自然界，同一辣椒植株同时遭受两种或两种以上病毒侵染(复合侵染)的情况非常普遍，复合侵染不仅能削弱寄主的抗性，加重病害症状，还使得病害的症状更加复杂，给病害识别带来很大的困难，直接影响病害的及时防治。2016年贵州省贵阳市自然发生的辣椒病毒病为害严重，且病害症状复杂，经小RNA深度测序和PCR鉴定发现是BBWV-2CMV、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒侵染所致，因此生产上急需准确、快速、简便、易操作的方法同时鉴别多种病毒病害。随着分子生物学技术的长足发展，基于核酸操作的多项技术在病毒病害的检测中发挥了巨大的作用，如多聚酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、基因芯片、核酸等温扩增等技术可同时检测多个靶标病原物，具有快速、准确、样品消耗少等特点。多重PCR(multiplexPCR)技术因其快速、灵敏、准确等优点已被广泛应用于病毒、细菌、真菌等病原物的检测和鉴定，为病害的早期诊断发挥了巨大的作用。多重PCR是指在同一个PCR反应体系中同时加入两种或两种以上的靶标病原物的核苷酸模板和特异性引物对，通过一次反应扩增片段大小不同的两种或两种以上的目的基因，从而同时区别两种或两种以上靶标病原物。基于此原理，本专利技术建立了隶属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和马铃薯Y病毒(PVY)以及豇豆花叶病毒科(Comoviridae)蚕豆病毒属(Fabavirus)的典型种蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)等四种辣椒病毒的多重PCR检测体系，该体系可以准确、高效、快速的鉴定田间自然发病的辣椒标样，为辣椒病害的早期诊断和鉴定提供手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于同步检测侵染辣椒的四种病毒的方法。该方法能够准确、高效、灵敏的同时检测多种植物病毒病标样。一种同步检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物对：扩增BBWV2的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，SEQIDNO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；扩增PVY的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，SEQIDNO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；扩增ChiVMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，SEQIDNO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；扩增CMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；SEQIDNO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。所述PCR体系中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV引物的摩尔比分别为2.5：1：2.5：1。所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA2μL、10mMdNTPs3μL、rTaq1.5U、25mM的MgCl21.5μL以及10μmol/L的BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV上下游引物分别为0.5μL、0.2μL、0.5μL、0.2μL。所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、57℃退火45秒和72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。上述方法在同步检测农作物中四种辣椒病毒病原BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV中的应用。所述农作物为辣椒。一种检测试剂盒，含有上述四对引物。本专利技术提供的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒的特异性引物对，通过RT-PCR分别可以获得1406bp,1202bp,600bp和376bp的单一的特异性条带。通过对PCR反应体系和反应条件的优化，建立了同步检测上述4种病毒的多重RT-PCR方法，突破了同步检测侵染辣椒的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种病毒的技术瓶颈，也可以为其他病毒病原的鉴定提供借鉴。具体
技术实现思路
涉及到：1)病毒RNA的提取；2)特异性引物对的设计和特异性分析；3)四种病毒的PCR鉴定体系；4)基于单重PCR技术的多重PCR检测方法的建立与优化；5)多重PCR检测方法灵敏度的测定。本专利技术的多重PCR反应的最佳体系和条件经优化确定为：10mMdNTPs3μL、rTaq1.5U、25mMMgCl21.5μL，以及57℃的退火温度。多重PCR扩增的最佳反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、57℃退火45秒、72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。所述四种病毒的特异性引物对可作为组合同步检测辣椒上的BBWV2、PVY、ChiVMV、CMV四种病毒，PCR检测均能获得单一的特异性条带，可以用于鉴定4种辣椒病毒病。所述四种病毒复合侵染的辣椒标样为田间自然发病植株，采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同步检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种辣椒病毒的多重RT‑PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物：扩增BBWV2的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1：5′‑GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG‑3′，SEQ ID NO.2：5′‑CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC‑3′；扩增PVY的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.3：5′‑CGGTTCGTTTGAATGCAAGC‑3′，SEQ ID NO.4：5′‑CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG‑3′；扩增ChiVMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，SEQ ID NO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；扩增CMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.7：5′‑AAANCTTGTTTCGCGCATTCA‑3′；SEQ ID NO.8：5′‑GAGGGAGGGTTCTGGGAACA‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种同步检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物：扩增BBWV2的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，SEQIDNO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；扩增PVY的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，SEQIDNO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；扩增ChiVMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，SEQIDNO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；扩增CMV的特异性引物的核苷酸序列为：SEQIDNO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；SEQIDNO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR体系中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV引物的摩尔比分别为2.5：1：2.5：1。3.根据权利要求2所述的方法，所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA2μL、10mMdNTPs3μL、rTaq1.5U、25mM的MgCl21.5μL以及10μmol/L的BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV上下游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莉，冯耿，王锡锋，刘文文，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11