K亚群禽白血病病毒荧光定量RT‑PCR检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种K亚群禽白血病病毒荧光定量RT‑PCR检测引物组及试剂盒。本发明专利技术所采用的引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。其能够特异性的扩增出ALV‑K，种内和种间的特异性均非常好；最低能够检测到8.4×10 copies/μL的病毒，灵敏度是普通PCR的100倍；批内变异系数和批间变异系数均小于5%，证明此方法特异性强，灵敏度高，重复稳定性好，扩增效率高，可以用于临床ALV‑K的检测。

【技术实现步骤摘要】
K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒
本专利技术属于分子检测领域，具体涉及一种K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测引物组及试剂盒。
技术介绍
禽白血病病毒(Avianleukosisviruses,ALVs)是反转录病毒科、肿瘤病毒亚科的一员，该病毒群引起的所有良性和恶性肿瘤统称为禽白血病(avianleukosis,AL)。(殷震，1997)。禽白血病被列为2012-2020年国家优先防治的动物疫病之一(高鸿宾，2012)。禽白血病病毒诱发的肿瘤主要包括白血病、结缔组织肿瘤、上皮性肿瘤、内皮性肿瘤及其他相关肿瘤，其中白血病又可分为淋巴细胞性白血病(LymphoidLeucosis,LL)、成红细胞性白血病(Erythroblastosis,EB)、成髓细胞性白血病(Myeloblastosis,MB)和髓细胞性白血病(Myelocytomatosis,ML)(Purchaseetal.,1984；霍夫斯塔，1980)。目前，病毒分离鉴定是检测禽白血病病毒最常规基础的方法，主要是测定病毒或病毒抗原，准确性较高、易操作。其缺点在于耗时长，从采样到检出结果至少需要10天时间；存在假阳性或病毒隐性未检出的可能性；花费高；操作流程繁琐。因此，该方法不适用于大范围、多样品的检测，难以在临床中推广和应用。病毒中和试验是检测禽白血病病毒最灵敏的方法之一。但存在操作步骤繁琐，耗时耗力，花费高等缺点，临床实际检测中很少用到。琼脂扩散试验是哈尔滨兽研所在20世纪80年代建立的方法。该方法需要拔羽取髓，会引起鸡群较大的应激反应，同时特异性也较低，会受内源性病毒的干扰，出现一定的假阳性。(关云涛等，2002)。IFA的基本原理是根据抗原-抗体反应，将荧光色素标记在已知抗体(或抗原)上，当其与对应的抗原(或抗体)结合后，就能够在荧光显微镜下观察到特异性的荧光信号。IFA的主要特点是特异性强，反应速度快，结果易观察，但是，操作步骤繁琐，专业要求高，耗时长，敏感度低，会因非特异染色而出现假阳性，在临床上推广范围较窄。近几年来，禽白血病发生频繁，给我国农业经济的发展带来很大冲击。经典外源性的禽白血病病毒亚群ALV-A、ALV-B、ALV-J在检测、净化等方面已经相对成熟，而对于在2008年才发现命名的ALV-K亚群，在相关方面的研究非常滞后。因此，建立一种快速有效的针对ALV-K的检测方法就显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、简单快速的K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测方法及试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针，其是根据K亚群禽白血病病毒序列进行设计的。作为优选的，所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。所述引物对和探针的核苷酸序列如下所示：ALV-F：5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’(SEQIDNO.1)，ALV-R：5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’(SEQIDNO.2)，ALV-Pb：5’-CCATGTTAGCACCCAACCACACAGAA-3’(SEQIDNO.3)。一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其含有如上所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针。一种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的方法，包括如下步骤：(1)提取样品中病毒RNA；(2)利用权利要求1-3任一项所述的引物对和探针对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增；(3)收集荧光信号，对比标准曲线，计算得到病毒拷贝数。RT-PCR扩增反应的条件为：42℃5min，95℃0.1min，95℃0.05min，60℃0.34min，共40个循环。本专利技术的有益效果是：本专利技术设计的引物和探针，能够特异性的扩增出ALV-K，种内和种间的特异性均非常好；构建阳性重组质粒，制作标准曲线，阳性质粒在8.4×1010copies/μL～8.4×101copies/μL之间呈现良好的线性关系，y＝-3.402x+48.355，斜率为-3.402，相关系数为R2为0.998，扩增效率Eff％为96.768；最低能够检测到8.4×10copies/μL的病毒，灵敏度是普通PCR的100倍；批内变异系数和批间变异系数均小于5％，证明此方法特异性强，灵敏度高，重复稳定性好，扩增效率高，可以用于临床ALV-K的检测。附图说明图1为阳性重组质粒PCR扩增产物的凝胶电泳图(M.DNAMarker4500；1.RT-PCR产物；2.重组质粒PCR产物；3.阴性对照)；图2为ALV-K实时荧光定量RT-PCR的标准曲线。图3荧光定量RT-PCR的种内特异性实验结果图；图4荧光定量RT-PCR的种间特异性实验结果图；图5荧光定量RT-PCR的灵敏度实验结果图(1-10模板含量分别为(单位copies/μL)：8.4×1010；8.4×109；8.4×108；8.4×107；8.4×106；8.4×105；8.4×104；8.4×103；8.4×102；8.4×101)；图6普通PCR的灵敏度实验结果图(1-9模板含量分别为(单位copies/μL)：8.4×1010；8.4×109；8.4×108；8.4×107；8.4×106；8.4×105；8.4×104；8.4×103；10为阴性对照)；图7为ALV-K对机体生长发育的影响柱形图；图8不同脏器中基因拷贝数的比较。具体实施方式下面结合实施了对本专利技术做进一步的说明，但并不局限于此。实施例1K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立1实验材料毒株、细胞美国ATCC鸡胚成纤维细胞系(DF-1)、A亚群禽白血病RAV-1株(GenBank登录号：M19113)、B亚群禽白血病RAV-2株(GenBank登录号：M14902)、J亚群禽白血病HPRS-103株(GenBank登录号：Z46390)、E亚群禽白血病RAV-0株(GenBank登录号：M12172)、K亚群禽白血病GDFX0601株(GenBank登录号：KP686142.1)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)为华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。2实验方法与结果2.1阳性重组质粒的构建参考GDFX0601株前病毒全基因组，设计了一对引物用于质粒标准品的构建：env-F：5’-CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC-3’(SEQIDNO.4)；env-R：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCATTTTCG-3’(SEQIDNO.5)。利用该引物对特异性的扩增ALV-K，目的基因1850bp，琼脂凝胶电泳结果显示在1850bp附近有一条特异性的目的条带；再以构建的阳性质粒为模板，得到预期大小的目的条带(图1)，测序结果显示插入的基因序列与目的基因一致，结果表明阳性重组质粒构建成功。质粒标准品的定量：DNA拷贝数＝{[X(g/μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT‑PCR检测的引物对及探针，其特征在于，所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列进行设计的。

【技术特征摘要】
1.种用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针，其特征在于，所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列进行设计的。2.根据权利要求1所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针，其特征在于，所述引物对和探针是根据K亚群禽白血病病毒序列的gp85区段进行设计的。3.根据权利要求2所述的用于K亚群禽白血病病毒荧光定量RT-PCR检测的引物对及探针，其特征在于，所述引物对和探针的核苷酸序列如下所示：ALV-F：5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’，ALV-R：5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’，ALV-Pb：5’-CCATGTTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素，陈轩，苏惠龙，邵建宏，黄海超，赵福振，沙才华，赵海燕，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44