一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术提供了一种同时鉴别8种鸡传染性免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒和检测方法。该试剂盒是基于GeXP系统使用的，包含8对PCR引物，检测结果表明，该试剂盒特异性强，灵敏度高，可以用于同时鉴别检测鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快 速检测试剂盒和检测方法。 -种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒 和检测方法
技术介绍
鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽 呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒均为传染性的可导致鸡免疫抑制的 病毒。鸡感染鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒 后可引起病鸡发生肿瘤，且也可引起终身的免疫抑制。鸡感染禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血 病毒和传染性法氏囊炎病毒后也能长时间的抑制鸡的免疫功能。鸡感染这些病毒以后，免 疫功能受到抑制，注射疫苗后抗体产生迟缓，抗体水平低，容易继发感染其他细菌性疾病， 鸡生长缓慢，是阻碍养鸡行业发展的重要因素。 鉴别诊断这些鸡免疫抑制病的传统方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验 等，但这些方法常受临床病材料新鲜度、污染程度或病程等因素的限制，操作也十分繁琐、 费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已 被广泛应用于这些鸡传染病的检测，并建立了多重PCR检测技术，同时检测几种病原，但需 几对引物组合在一起同时竞争的扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性 就越低。PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条 带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR-般只检测到3重，由 于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此， 也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物 二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限（多在2-4个基因），使得多重PCR 还达不到高通量快速检测和分析的目的。 GeXP 系统（Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国 Beckman Coulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成：用于设 计引物的 GeXP Expression Profiler 软件和用于结果分析的 GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp以上的相邻扩增片段。GeXP 多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物（即基因特异性引物5'端连接 通用引物序列）相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原 始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、 反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序 列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增， 通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离， 含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段（DNA Size Standard，DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含 量。GeXP系统可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试 剂盒。 上述所述试剂盒包括用于鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的引物组，为如下8种引 物对： (1)用于鉴定鸡马立克氏病病毒的引物对A :-条序列如序列表中序列1，另一条 序列如序列表中序列2所示； (2)用于鉴定A亚群禽白血病病毒的引物对B :-条序列如序列表中序列3,另一 条序列如序列表中序列4所示； (3)用于鉴定B亚群禽白血病病毒的引物对C:一条序列如序列表中序列5,另一 条序列如序列表中序列6所示； (4)用于鉴定J亚群禽白血病病毒的引物对D :-条序列如序列表中序列7,另一 条序列如序列表中序列8所示； (5)用于鉴定禽网状内皮组织增生症病毒的引物对E :-条序列如序列表中序列 9,另一条序列如序列表中序列10所7]^ ; (6)用于鉴定禽呼肠孤病毒的引物对F :-条序列如序列表中序列11，另一条序列 如序列表中序列12所示； (7)用于鉴定鸡传染性贫血病毒的引物对G :-条序列如序列表中序列13,另一条 序列如序列表中序列14所示； (8)用于鉴定传染性法氏囊炎病毒的引物对Η :-条序列如序列表中序列15,另一 条序列如序列表中序列16所示。 上述所述引物组在制备检测8种鸡免疫抑制病病原体的试剂盒中的应用。 上述所述8种鸡免疫抑制病病原体为鸡马立克氏病病毒、Α亚群禽白血病病毒、Β 亚群禽白血病病毒、J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传 染性贫血病毒或传染性法氏囊炎病毒。 上述所述鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的引物组中的引物对混合使用。 上述所述的检测为利用GeXP系统进行检测。 本专利技术利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能同时鉴别多种病原体 的检测方法和检测试剂盒，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多 重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。 本专利技术提供了一种同时鉴别8种鸡传染性免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试 剂盒和检测方法。该试剂盒是基于GeXP系统使用的，包含8对PCR引物，检测结果表明，该 试剂盒特异性强，灵敏度高，可以用于同时鉴别检测鸡马立克氏病病毒、A、B和J亚群禽白 血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊 炎病毒。 【附图说明】 图1为A亚群禽白血病病毒前病毒DNA、J亚群禽白血病病毒前病毒DNA和禽网状 内皮组织增生症病毒前病毒DNA混合模板的GeXP八重PCR的毛细管电泳分析图。 图2为A亚群禽白血病病毒前病毒DNA、J亚群禽白血病病毒前病毒DNA和禽呼肠 孤病毒的cDNA混合模板的GeXP八重PCR的毛细管电泳分析图。 图3为八种鸡传染性疾病病原的GeXP八重PCR的毛细管电泳分析图。 【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 鸡马立克病病毒记载在曾婷婷，谢芝勋，谢丽基，等。网状内皮组织增生症病毒改 良型LAMP检测方法的建立，动物医学进展，2013, 34⑶：30-34中，公众可从广西壮族自治 区兽医研究所获得。 A(RSV-A)、B(RSV_B)亚群禽白血病病毒毒株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中 心，该中心可向公众出售该毒株。 J亚群禽白血病病毒记载在曾婷婷，谢芝勋，谢丽基，等。网状内皮组织增生症病 毒改良型LAMP检测方法的建立，动物医学进展，2013, 34 (8) :30-34中，公众可从广西壮族 自治区兽医研究所获得。 禽网状内皮组织增生症病毒记载在曾婷婷，谢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的引物组，为如下8种引物对：(1)用于鉴定鸡马立克氏病病毒的引物对A：一条序列如序列表中序列1，另一条序列如序列表中序列2所示；(2)用于鉴定A亚群禽白血病病毒的引物对B：一条序列如序列表中序列3，另一条序列如序列表中序列4所示；(3)用于鉴定B亚群禽白血病病毒的引物对C：一条序列如序列表中序列5，另一条序列如序列表中序列6所示；(4)用于鉴定J亚群禽白血病病毒的引物对D：一条序列如序列表中序列7，另一条序列如序列表中序列8所示；(5)用于鉴定禽网状内皮组织增生症病毒的引物对E：一条序列如序列表中序列9，另一条序列如序列表中序列10所示；(6)用于鉴定禽呼肠孤病毒的引物对F：一条序列如序列表中序列11，另一条序列如序列表中序列12所示；(7)用于鉴定鸡传染性贫血病毒的引物对G：一条序列如序列表中序列13，另一条序列如序列表中序列14所示；(8)用于鉴定传染性法氏囊炎病毒的引物对H：一条序列如序列表中序列15，另一条序列如序列表中序列16所示。

【技术特征摘要】
1. 一种用于鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的引物组，为如下8种引物对： (1) 用于鉴定鸡马立克氏病病毒的引物对A :-条序列如序列表中序列1，另一条序列 如序列表中序列2所示； (2) 用于鉴定A亚群禽白血病病毒的引物对B :-条序列如序列表中序列3,另一条序 列如序列表中序列4所示； (3) 用于鉴定B亚群禽白血病病毒的引物对C :一条序列如序列表中序列5,另一条序 列如序列表中序列6所示； (4) 用于鉴定J亚群禽白血病病毒的引物对D :-条序列如序列表中序列7,另一条序 列如序列表中序列8所示； (5) 用于鉴定禽网状内皮组织增生症病毒的引物对E :-条序列如序列表中序列9,另 一条序列如序列表中序列10所示； (6) 用于鉴定禽呼肠孤病毒的引物对F :-条序列如序列表中序列11，另一条序列如序 列表中序列12所示； (7) 用于鉴定鸡传染性贫血病毒的引物对G :-条序列如序列表中序列13,另一条序列 如序列表中序列14所示； (8) 用于鉴定传染性法氏囊炎病毒的引物对Η :-条序列如序列表中序列15,另一条序 列如序列表中序列16所示。2. 权利要求1所述引物组在制备检测或辅助检测8种鸡免疫抑制病病原体的试剂盒中 的应用； 所述8种鸡免疫抑制病病原体为鸡马立克氏病病毒、Α亚群禽白血病病毒、Β亚群禽白 血病病毒、J亚群禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血 病毒或传染性...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，曾婷婷，谢丽基，罗思思，邓显文，谢志勤，范晴，刘加波，庞耀珊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45