免疫抑制细胞及其制造和使用方法技术

本发明专利技术涉及一种免疫抑制细胞及其制造和使用方法。所述免疫抑制细胞通过将一前驱细胞培养于含有GRO趋化激素之培养基中而得到。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】【相关申请】本申请要求申请日为2012年6月4日的美国临时申请N0.61/655，191的优先权，该申请的全部内容以引用方式全部合并于此。【先前技术】髓源性抑制细胞(MDSCs)是一群包含有早期髓系前驱细胞/粒细胞异质群体、巨噬细胞和树突状细胞等异细胞亚群的集合体。这些细胞通常由髓系标记Gr-1和CDllb表现其特征。髓源性抑制细胞由于可藉由增加免疫抑制因子，例如精氨酸酶I(ARG-1)和一氧化氮合酶2(N0S2)之表现来抑制T细胞效应之功能，而在肿瘤免疫逃逸机制、自体免疫疾病、移植排斥反应，慢性炎症及感染等方面扮演重要角色。参见(例如)，Gabrilovich与Nagaraj, Nat Rev Tmmunol 9:162-174(2009)。由于髓源性抑制细胞所具有之免疫抑制特性，而使其能做为治疗免疫性疾病的候选药物。因此，亟需一种藉由得自活体培养方式产生之稳定且安全的髓源性抑制细胞。【
技术实现思路
】本专利技术基于此发现，生长调节致癌基因(GRO)趋化激素，尤其是GRO-γ，对于人类周边血单核细胞衍生的树突状细胞(MDDCs)之分化及功能具有抑制作用。此外，发现GRO-y可驱动MDDCs分化成为一种类似髓源性抑制细胞(MDSC)的表现型。因此，本专利技术所描述系关于一种获得免疫抑制细胞的方法。该方法包括:获得一种能分化成树突状细胞之前驱细胞；及将该前驱细胞培养于含有一趋化激素之培养基中一段足够使该前驱细胞分化为树突状细胞的时间，其中该树突状细胞系呈现一种免疫抑制表型，而藉此获得该免疫抑制细胞。所述之趋化激素可为一种GRO趋化激素，例如，GRO-γ或GRO- α。另一方面，本专利技术包含一种藉由上述方法得到之免疫抑制细胞，及含有该细胞的组成物。本专利技术亦描述一种使用上述细胞或细胞组成物治疗个体中各种病况之方法。例如，本专利技术之细胞或细胞组成物可用于有需要之个体中抑制免疫反应，调节与肿瘤发生相关之血管新生，治疗自身免疫疾病，治疗发炎性疾病，或治疗移植物对抗宿主疾病(GVHD)。【图式简单说明】图1表示间叶系干细胞(MSC)-条件培养基对于MDDC分化产生了抑制效果。将纯化来自人类PBMCS的⑶14+单核细胞培养在有或无MSC-条件培养基(MSC-CM) (1/2Χ体积)存在下培养于DC-分化培养基中。于第5天iDC再经无或以LPS(lmg/mL)处理(mDC)两天。于第7天分析MDDCs的表型和功能。㈧针对与DC成熟相关之表面标记进行染色，并以流式细胞仪分析，测定10，000个细胞的平均荧光强度(MFI)。(B)未成熟之MDDCs以荧光标记葡聚糖试剂(lmg/mL)于37°C下施予脉冲30分钟，并藉由以流式细胞仪测量之FITC-葡聚醣摄取量分析其内吞能力。所显示于FITC-葡聚醣摄入后之FACS图谱为:无FTIC-葡聚醣存在下的MDDCs作为阴性对照组(NC，灰线)，iMDDCs (iDC,虚线)，及有MSC-CM存在下之iMDDCs具(iDC+MSC-CM，黑色实线)。数据为于2位供者进行之三次独立实验的代表性结果。(C)成熟MDDCs与同种异体之T细胞共培养4天(DC:T = 1:10)，并于以I μ Ci/孔之-胸苷施予脉冲16小时后测量定与胸苷的并入量。藉由于三名供者各重复三次所测得之-胸苷并入量来测定T细胞增生。数据以相对于无MSC-CM补充组之倍数(MFI 土 SD)，或以-胸苷摄取量之CPM(平均值土SD)表示。数据代表三次独立实验之结果。(η =3 位供者，每次实验)ο *:ρ<0.05 ;林:p<0.01 ;***:ρ<0.0001ο图2表示MSC-CM对MDDCs的抑制效果可藉由将抗-GRO- γ中和抗体加入MSC-CM而产生逆转。(A)使用市售之人类细胞激素/趋化激素抗体数组(RayB1)比较得自MSC条件培养基(MSC-CM)与含血清培养基对照组的细胞激素图谱。培养基中所含细胞激素和趋化激素的量，系藉由将所述之数组膜先与对抗特定细胞激素或趋化激素之生物素标记的抗体，之后再与HRP-共轭的卵白素进行培养，然后将其以X-射线底片曝光而测定得。实验重复2次。(B)以流式细胞仪分析GRO趋化激素及IL-8对于未成熟MDDCs上之⑶40之表现的影响。将人类⑶14+单核细胞于IL-4(80ng/mL)和GM-CSF(80ng/mL)存在下，在含有10%人类AB+血清之a-MEM培养基中进行分化。于第7天，将⑶14 +单核细胞、单独之未成熟MDDCs或补充以GRO- a、GRO- β、GRO- γ或IL-8之未成熟MDDCs进行针对CD40表现之染色，并以流式细胞仪分析。灰线对应未染色的对照组。所示数据为对应所指定趋化激素之⑶40阳性细胞的百分比。实验结果来自三个独立实验。(C)以抗-GRO-γ (10 μ g/mL)抗体或同种型匹配的对照抗体于37 °C下培养60分钟，将MSC-CM中的GRO- γ活性中和，之后放置于4°C下隔夜。将MDDCs在有或不含MSC-CM(1/2X体积)之DC分化培养基中，于有或无中和性抗-GRO-γ抗体存在下进行分化。利用流式细胞仪进行MDDCs表型分析，结果以平均荧光强度相对于未经处理之iDC(MFI土SD)所获得数值的倍数表示。结果来自两个实验，每组包括两名供者。*:ρ〈0.05 ;林:p<0.0lo图3显示GRO- γ抑制MDDCs的分化。纯化自人类PBMCs之⑶14+单核细胞于有或无重组GRO-γ (250ng/mL)存在下，经过或未经CXCR2受体竞争型拮抗剂SB225002 (250nm)预处理30分钟的条件下进行分化。于第7天，分析MDDCs的表型和功能。(A)经过表面标记标定后，使用流式细胞仪进行MDDCs的表型分析。条形图代表相对于未经处理之iDCS所获得之MFI的MFI倍数(MFI ± SD之倍数)。数据相当于三个独立实验之平均值，其中每个实验包括两至三名供者。(B)在37°C下，将未成熟之MDDCs以FITC-葡聚醣(lmg/mL)施予脉冲30分钟，并以流式细胞仪测定其摄取情形。数据系来自五个不同实验，且以相对于iDC组之MFIiSD的倍数表示。η = 2-3。(C)将成熟MDDCs与同种异体T细胞(DC:T = 1:10)共培养4天，并于以I μ Ci/孔之-胸苷施予16小时-脉冲后胸苷与测定胸苷并入量。以-胸苷并入量来测定T细胞增生。数据以相对于未经处理之MMDCs之CPM(平均值土SD)的倍数表示，且数据系来自五个独立的实验。η = 2-3ο *:ρ<0.05:ρ<0.01 ;***:ρ〈0.0OOl0图4显示于GRO-γ存在下分化的MDDCs具有细胞激素耐受性。将纯化自人类PBMCs之⑶14+单核细胞于有或无重组GRO-γ (250ng/mL)存在下，经过或未经CXCR2受体竞争型拮抗剂SB225002 (250nm)预处理30分钟的条件下进行分化。(A)以实时RT-PCR测定培养7天之MDDCs的mRNA表现。将Ct值以GAPDH基因之表现量为基准归一化。以2_Λ ct法计算差异值，且数据以相对于未经处理之DC所获得之值的百分比表示。结果代表得自五个独立的实验重复三次的平均值±标准偏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫抑制细胞的制造方法，该方法包括取得一能够分化成树突状细胞之前驱细胞；将该前驱细胞培养于含有一趋化激素之培养基中一段足够使该前驱细胞分化为树突状细胞的时间，其中该树突状细胞系呈现一种免疫抑制表现型，而藉此获得该免疫抑制细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：许素菁，陈信伟，庄再成，陈欣瑜，王丽姿，
申请(专利权)人：财团法人卫生研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71