一种鸡安卡拉病检测方法技术

本发明专利技术属于禽类疾病检测技术领域，公开了一种鸡安卡拉病检测方法；准备质粒和毒株：提取样品DNA；设计与合成引物、探针；确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV‑4合成质粒稀释浓度为10

A Detection Method for Chicken Ankara Disease

The invention belongs to the technical field of poultry disease detection, and discloses a detection method for chicken Ankara disease; preparation plasmid and virus strain: extraction of sample DNA; design and synthesis of primers and probes; determination of fluorescence reaction system and reaction procedure; dilution concentration of synthetic plasmid FAdV_4 is 10.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡安卡拉病检测方法
本专利技术属于禽类疾病检测
，尤其涉及一种鸡安卡拉病检测方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：心包积水综合征(Hydropericardiumsyndrome,HPS)又称鸡安卡拉病，病原为鸡腺病毒(Fowladenovirus,FAdV)，属于无囊膜的线性单分子双股DNA病毒。FAdV血清型众多，分别为血清型1～7，8a，8b，9～11共12种，不同血清型会导致不同程度的包涵体肝炎。其中血清4型强毒株对雏鸡的致病能力较强，是导致HPS发生的主要原因。腺病毒科(Adenoviridae)分五个属，禽腺病毒属(adenovirus)是其中之一，禽腺病毒属又分为禽腺病毒A～E、鹅腺病毒A、隼腺病毒A、及火鸡腺病毒B共8个种。FAdV-4和FAdV-10同属于禽腺病毒C。FAdV呈世界性分布，1987年在安卡拉镇首次发生了鸡安卡拉病，1989年也报道了在墨西哥该病的发生，随后在印度、伊拉克、秘鲁、智利、厄瓜多尔、俄罗斯等地该病陆续的暴发。2015年6月以来，我国多数省份也发生了此类症状。该病的临床症状为发病鸡常表现为食欲不振、贫血、粗乱的羽毛、鸡冠颜色变浅、嗜睡发生率增高等，死亡率高达30％-90％，造成巨大的影响和经济损失。发病鸡主要表现为精神沉郁、羽毛逆立、排黄色稀粪，突然倒地后两腿划空，数分钟内死亡，剖检可见心包积有淡黄色透明的渗出液；肝脏肿胀、充血、质地变脆，色泽变暗，并出现坏死；肾苍白或暗黄色。综上所述，现有技术存在的问题是：现有的检测方法特异性较差，灵敏度较差，稳定性较差。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种鸡安卡拉病检测方法。本专利技术是这样实现的，一种鸡安卡拉病检测方法，具体包括以下步骤：步骤一：准备质粒和毒株：根据FAdV-1、FAdV-2、FAdV-4、FAdV-10的Fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取其RNA并反转录成cDNA；步骤二：提取样品DNA：取20份鸡肝脏、脾脏、肾脏并提取DNA；步骤三：设计与合成引物、探针：根据FADV的12种血清型的核苷酸序列，使用ClustalX进行比对，并通过PrimerExpress3.0在高度保守区域设计特异性的荧光PCR引物、探针一套，并合成；步骤四：确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV-4合成质粒稀释浓度为107作为模板，使用各自的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增；步骤五：对鸡安卡拉病检测方法进行灵敏度检测和特异性检测。进一步，步骤二中，获得的样品DNA模板的260/280比值在1.8～2.0之间，浓度在200～500ng/μL之间，适合后续的扩增反应。进一步，步骤三中，合成后的引物、探针用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，-20℃保存。进一步，步骤四中，荧光PCR反应体系：Takara2×TaqPCRMastermix12.5μL，上下游引物各0.5μL(引物浓度10μmol/L)，探针1.0μL(探针浓度10μmol/L)，DNA模版2.0μL，补水至25μL。进一步，步骤四中，荧光PCR反应程序：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环，于60℃30s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。进一步，步骤五中，灵敏度检测，具体步骤为：(1)将FAdV-4合成质粒为阳性标准品；(2)用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算为目的基因的拷贝数，以10倍梯度稀释至101拷贝/μL，对梯度稀释的阳性对照进行荧光PCR反应检测；(3)对阳性标准品以101为单位进行倍比稀释，将得到的浓度为109至101的9个模板使用步骤后的反应体系和反应条件进行扩增，验证所建立方法的灵敏度。进一步，步骤五中，特异性检测，具体步骤为：(1)以FAdV-1、FAdV-2、FAdV-10各一份的Fiber全基因合成质粒；(2)鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗的cDNA；(3)1份FAdV-4合成质粒为模板，使用步骤四的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增，验证所设计引物探针及所建立方法的特异性。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术提供的鸡安卡拉病检测方法，特异性强，在对其它血清型的质粒和鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗cDNA产物进行扩增后，未出现扩增曲线或条带；灵敏度高，荧光PCR可做到101拷贝的数量级；稳定性强，在不同时间对相同20份样品进行测试，两次结果均未出现明显变化。TaqMan方法配套扩增试剂便宜且方法成熟，接受程度高，可满足检测要求，适用于鸡中HPS病毒的检测。现有的检测方法主要包括血清学检测和普通PCR方法检测，本专利技术优于现有检测方法，荧光PCR在普通PCR基础上得益于探针的加入，即使引物发生错配，探针也不会释放信号，使得特异性更高。荧光PCR在扩增时是通过探针释放荧光信号后用电脑实时监测PCR产物每个循环的积累总量，在PCR产物含量低的情况下，灵敏度要比普通PCR高。附图说明图1是本专利技术实施例提供的鸡安卡拉病检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的安卡拉病荧光PCR检测方法建立示意图。图3是本专利技术实施例提供的安卡拉病荧光PCR方法特异性试验结果示意图。图4是本专利技术实施例提供的安卡拉病荧光PCR方法灵敏度检测结果示意图。图5是本专利技术实施例提供的第一次稳定性试验结果示意图。图6是本专利技术实施例提供的第二次稳定性试验结果示意图。图7是本专利技术实施例提供的鸡样品荧光PCR检测结果示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细说明；如图1所示，本专利技术实施例提供的鸡安卡拉病检测方法，具体包括以下步骤：S101：准备质粒和毒株：根据FAdV-1、FAdV-2、FAdV-4、FAdV-10的Fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取其RNA并反转录成cDNA；S102：提取样品DNA：取20份鸡肝脏、脾脏、肾脏并提取DNA；S103：设计与合成引物、探针：根据FADV的12种血清型的核苷酸序列，使用ClustalX进行比对，并通过PrimerExpress3.0在高度保守区域设计特异性的荧光PCR引物、探针一套，并合成；S104：确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV-4合成质粒稀释浓度为107作为模板，使用各自的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增；S105：对鸡安卡拉病检测方法进行灵敏度检测、特异性检测和稳定性检测。步骤S102中，本专利技术实施例提供的获得的样品DNA模板的260/280比值在1.8～2.0之间，浓度在200～500ng/μL之间，适合后续的扩增反应。步骤S103中，本专利技术实施例提供的合成后的引物、探针用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，-20℃保存。步骤S104中，本专利技术实施例提供的荧光PCR反应体系：Takara2×TaqPCRMastermix12.5μL，上下游引物各0.5μL(引物浓度10μmol/L)，探针1.0μL(探针浓度10μmol/L)，DNA模版2.0μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述的鸡安卡拉病检测方法包括以下步骤：步骤一：准备质粒和毒株：根据FAdV‑1、FAdV‑2、FAdV‑4、FAdV‑10的Fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取RNA并反转录成cDNA；步骤二：提取样品DNA：取20份鸡肝脏、脾脏、肾脏并提取DNA；步骤三：设计与合成引物、探针：根据FADV的12种血清型的核苷酸序列，使用Clustal X进行比对，并通过Primer Express 3.0在高度保守区域设计特异性的荧光PCR引物、探针一套，并合成；步骤四：确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV‑4合成质粒稀释浓度为10

【技术特征摘要】
1.一种鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述的鸡安卡拉病检测方法包括以下步骤：步骤一：准备质粒和毒株：根据FAdV-1、FAdV-2、FAdV-4、FAdV-10的Fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取RNA并反转录成cDNA；步骤二：提取样品DNA：取20份鸡肝脏、脾脏、肾脏并提取DNA；步骤三：设计与合成引物、探针：根据FADV的12种血清型的核苷酸序列，使用ClustalX进行比对，并通过PrimerExpress3.0在高度保守区域设计特异性的荧光PCR引物、探针一套，并合成；步骤四：确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV-4合成质粒稀释浓度为107作为模板，使用各自的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增；步骤五：对鸡安卡拉病检测方法进行灵敏度检测和特异性检测。2.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤二中，获得的样品DNA模板的260/280比值1.8～2.0，浓度200～500ng/μL，适合后续的扩增反应。3.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤三中，合成后的引物、探针用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，-20℃保存。4.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤四中，荧光PCR反应体系：Takara2×TaqPCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵福振，苏惠龙，李儒曙，邵建宏，罗宝正，廖秀云，沙才华，陈轩，薄清如，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44