能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检验检疫领域，旨在提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒。该试剂盒中包括：预扩增引物混合液，含有序列如SEQ ID NO：1～14所示预扩增引物；探针混合液，含有序列如SEQ ID NO：15～28所示的左侧探针和右侧探针；MLPA缓冲液；连接缓冲液A；连接缓冲液B；连接酶Ligase‑65；PCR反应混合液，含有序列SEQ ID NO：29和30所示的通用引物；SALSA聚合酶；阴性对照；阳性对照。本发明专利技术所述试剂盒具有高通量特点，能同时检测7种病原，利用全自动核酸分析仪，每次可同时检测96个样品，为病原体的鉴别诊断和应急诊断提供高通量检测技术。另外，还具备特异性好和灵敏度高的优点，通过增加RT‑PCR步骤对目标基因进行富集，最低可检出1拷贝的目标基因。

Multiplex Connection Probe Amplification and Identification Kit for Detection of Several Avian Respiratory Pathogens

The invention relates to the field of inspection and quarantine, aiming at providing a multiplex connection probe amplification and identification kit capable of detecting various avian respiratory pathogens. The kit includes: pre-amplified primer mixtures containing pre-amplified primers with sequences such as SEQ ID NO:1-14; probe mixtures containing left and right probes with sequences such as SEQ ID NO:15-28; MLPA buffer; ligand buffer A; ligase B; ligase Ligase_65; PCR reaction mixtures containing universal sequences such as SEQ ID NO:29 and 30. Primers; SALSA polymerase; Negative control; Positive control. The kit has the characteristics of high throughput, can simultaneously detect seven pathogens, and can simultaneously detect 96 samples at a time by using an automatic nucleic acid analyzer, thus providing a high throughput detection technology for the differential diagnosis and emergency diagnosis of pathogens. In addition, it has the advantages of good specificity and high sensitivity. By adding RT-PCR steps to enrich the target gene, at least one copy of the target gene can be detected.

【技术实现步骤摘要】
能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒
本专利技术提供了一种用于检测禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的多重连接探针扩增鉴别检测试剂盒及引物和探针，可实现同时检测7种引起禽呼吸道疾病病原，属于检验检疫领域。
技术介绍
禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒是引起禽呼吸道疾病的常见病原。由于引起禽呼吸道症状的疾病不止一种，临床表现较为相似，且常见不同病原混合感染，使得通过临床症状和病理变化很难对致病原因进行确诊。目前尚没有一种方法可以一次性对引起禽呼吸道症状的多种疾病进行鉴别。因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于鉴别诊断禽呼吸道病原至关重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒。为解决技术问题，本专利技术采用以下技术方案：提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，该试剂盒中包括：(1)预扩增引物混合液；该混合液中包括预扩增引物，其序列如SEQIDNO：1～14所示；(2)探针混合液；该混合液中包括左侧探针和右侧探针，其序列如SEQIDNO：15～28所示；(3)MLPA缓冲液；(4)连接缓冲液A；(5)连接缓冲液B；(6)连接酶Ligase-65；(7)PCR反应混合液，其包括如序列SEQIDNO：29和30所示的通用引物；(8)SALSA聚合酶；(9)阴性对照；(10)阳性对照。本专利技术中，在所述预扩增引物混合液的预扩增引物中：序列SEQIDNO：1和序列SEQIDNO：2分别是禽流感病毒H9预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：3和序列SEQIDNO：4分别是禽流感病毒H5预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：5和序列SEQIDNO：6分别是禽流感病毒H7预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：7和SEQIDNO：8分别是新城疫病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：9和SEQIDNO：10分别是禽偏肺病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：11和SEQIDNO：12分别是禽传染性支气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：13和SEQIDNO：14分别是禽传染性喉气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；在所述探针混合液的探针中：序列SEQIDNO：15和SEQIDNO：16分别为检测禽流感病毒H9的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：17和SEQIDNO：18分别为检测禽流感病毒H5的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：19和SEQIDNO：20分别为检测禽流感病毒H7的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：21和SEQIDNO：22分别为检测新城疫病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：23和SEQIDNO：24分别为检测禽偏肺病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：25和SEQIDNO：26分别为检测禽传染性支气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：27和SEQIDNO：28分别为检测禽传染性喉气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；在所述PCR反应混合液的引物中，序列SEQIDNO：29和SEQIDNO：30分别是通用正向和反向引物；其中，序列SEQIDNO：16、SEQIDNO：18、SEQIDNO：20、SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26和SEQIDNO：28的5’端进行磷酸化处理。本专利技术中，所述阳性对照是基因体外转录RNA与阳性重组质粒DNA的混合物；其中基因体外转录RNA是指禽流感病毒H9的HA基因、禽流感病毒H5的HA基因、禽流感病毒H7的HA基因、新城疫病毒的M基因、禽偏肺病毒的N基因、禽传染性支气管炎病毒的M基因的体外转录RNA，阳性重组质粒DNA是指禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白C基因的阳性重组质粒DNA。本专利技术进一步提供了利用前述试剂盒同时检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增检测方法，包括以下步骤：(1)磁珠法提取样品DNA/RNA；使用磁珠DNA/RNA共提取试剂盒和全自动核酸提取仪，同时提取样品中的DNA和RNA，得到100μL样品；(2)RNA反转录成cDNA及预扩增进行一步法反转录RT-PCR反应；配制25μL反应体系：10μLOneStepAheadRT-PCRMasterMix，1μLOneStepAheadRT-Mix，5μLDNA或RNA，5μLQ-solution，终浓度为每条引物0.25μM的预扩增引物混合液共1μL，3μLH2O补足；反应条件：50℃10min，95℃5min；95℃15s，55℃20s，72℃20s，30个循环；72℃2min；(3)MLPA检测a、DNA变性取0.2mLPCR反应管，每管加入0.5μLDNA溶液和4.5μLTE，98℃变性5min，降至室温25℃；b、探针与样本DNA的杂交配制3μL混匀的探针混合液：1.5μLMLPA缓冲液+1.5μL探针混合液；将探针混合物加入上述PCR管中，95℃温育1min，60℃杂交1-16h，54℃温育；c、杂交探针的连接配制32μL连接酶混合物：25μLdH2O+3μL连接缓冲液A+3μL连接缓冲液B+1μL连接酶Ligase-65；PCR仪温度降至54℃，打开管盖，加入32μL连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育；d、连接探针的PCR扩增配制10μLPCR混合液：7.5μLdH2O+2μLPCR反应混合液+0.5μLSALSA聚合酶；取出PCR管，室温下加入10μLPCR混合物；开始PCR反应，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，降至15℃；e、全自动核酸分析仪分析：取PCR扩增产物，用全自动核酸分析仪进行分析；(4)结果描述及判定a、质控标准：阳性对照在92bp、97bp、102bp、120bp、127bp、134bp、142bp处有特异性扩增条带；阴性对照无特异性扩增条带；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效；b、结果判断：阳性：在92bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒H9；在97bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒H5；在102bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒H7；在120bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在新城疫病毒；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽偏肺病毒；在134bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性支气管炎病毒；在142bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性喉气管炎病毒；阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒。本专利技术中，在进行结果判断时，对MLPA扩增产物进行测序，进一步确认结果。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.高通量。同时检测7种病原，利用全自动核酸分析仪，每次可同时检测96个样品，为病原体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：(1)预扩增引物混合液；该混合液中包括预扩增引物，其序列如SEQ ID NO：1～14所示；(2)探针混合液；该混合液中包括左侧探针和右侧探针，其序列如SEQ ID NO：15～28所示；(3)MLPA缓冲液；(4)连接缓冲液A；(5)连接缓冲液B；(6)连接酶Ligase‑65；(7)PCR反应混合液，其包括如序列SEQ ID NO：29和30所示的通用引物；(8)SALSA聚合酶；(9)阴性对照；(10)阳性对照。

【技术特征摘要】
1.能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：(1)预扩增引物混合液；该混合液中包括预扩增引物，其序列如SEQIDNO：1～14所示；(2)探针混合液；该混合液中包括左侧探针和右侧探针，其序列如SEQIDNO：15～28所示；(3)MLPA缓冲液；(4)连接缓冲液A；(5)连接缓冲液B；(6)连接酶Ligase-65；(7)PCR反应混合液，其包括如序列SEQIDNO：29和30所示的通用引物；(8)SALSA聚合酶；(9)阴性对照；(10)阳性对照。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述预扩增引物混合液的预扩增引物中：序列SEQIDNO：1和序列SEQIDNO：2分别是禽流感病毒H9预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：3和序列SEQIDNO：4分别是禽流感病毒H5预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：5和序列SEQIDNO：6分别是禽流感病毒H7预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：7和SEQIDNO：8分别是新城疫病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：9和SEQIDNO：10分别是禽偏肺病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：11和SEQIDNO：12分别是禽传染性支气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；序列SEQIDNO：13和SEQIDNO：14分别是禽传染性喉气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；在所述探针混合液的探针中：序列SEQIDNO：15和SEQIDNO：16分别为检测禽流感病毒H9的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：17和SEQIDNO：18分别为检测禽流感病毒H5的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：19和SEQIDNO：20分别为检测禽流感病毒H7的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：21和SEQIDNO：22分别为检测新城疫病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：23和SEQIDNO：24分别为检测禽偏肺病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：25和SEQIDNO：26分别为检测禽传染性支气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；序列SEQIDNO：27和SEQIDNO：28分别为检测禽传染性喉气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；在所述PCR反应混合液的引物中，序列SEQIDNO：29和SEQIDNO：30分别是通用正向和反向引物；其中，序列SEQIDNO：16、SEQIDNO：18、SEQIDNO：20、SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26和SEQIDNO：28的5’端进行磷酸化处理。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照是基因体外转录RNA与阳性重组质粒DNA的混合物；其中基因体外转录RNA是指禽流感病毒H9的HA基因、禽流感病毒H5的HA基因、禽流感病毒H7的HA基因、新城疫病毒的M基因、禽偏肺病毒的N基因、禽传染性支气管炎病毒的M基因的体外转录RNA，阳性重组质粒DNA是指禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白C基因的阳性重组质粒DNA。4.利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：周莹珊，邵春艳，宋厚辉，王晓杜，陈琳，姜胜，宋泉江，周彬，杨杨，杨永春，孙静，程昌勇，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33