一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组及其应用，包括外侧引物PPV‑O‑F、PPV‑O‑R和内侧引物PPV‑I‑F、PPV‑I‑R；本发明专利技术采用上述巢式PCR引物组进行巢式PCR检测猪细小病毒的方法，包括如下步骤：将待测样本提取DNA得到样本DNA；将所述样本DNA进行两次PCR扩增，第一次PCR扩增采用外侧引物PPV‑O‑F与PPV‑O‑R，第二次PCR扩增采用内侧引物PPV‑I‑F与PPV‑I‑R；每次PCR产物进行电泳检测猪细小病毒。本发明专利技术所提供的巢式PCR引物组是针对猪细小病毒的结构蛋白VP2中碱基序列设计出的两对特异性引物，并且对多种病毒病原进行扩增，只有猪细小病毒可以扩增出特异条带，具有特异性。本发明专利技术提供的巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、抗干扰性能好，且可靠性强，克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差问题。

A universal nested PCR primer set for porcine parvovirus and its application

The invention provides a universal porcine parvovirus nested PCR primer group and its application, including the lateral primers PPV, O, F, PPV O O R and the medial primer PPV I I F, PPV PPV I; the invention adopts the nested primer group to carry out the detection of porcine parvovirus by nested PCR, including the following steps: extracting the samples to be detected and obtaining samples; and carrying out the two samples of the samples. R amplification, the first PCR amplification using lateral primers PPV O O F and PPV O O R, the second PCR amplification using medial primers PPV PPV I I, and each time the products were electrophoresis for detection of porcine parvovirus. The nested PCR primer group is designed for two pairs of specific primers targeting the nucleotide sequence of the structural protein VP2 of porcine parvovirus, and amplifies various viral pathogens. Only the PPV can amplify specific bands and has specificity. The nested PCR detection method provided by the invention has strong specificity, high sensitivity, good anti-interference performance and strong reliability, and overcomes the problems of low sensitivity and poor specificity of common PCR detection.

【技术实现步骤摘要】
一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组及其应用
本专利技术涉及分子诊断
，具体地，涉及一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组及其应用。
技术介绍
猪细小病毒(porcinecircovirus2，PPV)是能引起猪的繁殖障碍病，是目前威胁世界养猪业的重要病原之一。PPV主要感染妊娠前期的母猪,引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、木乃伊化、弱胎及不孕等危害，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。PPV可感染各阶段的猪，但除怀孕母猪和仔猪外，其他阶段的猪感染后均无明显临床症状。主要通过呼吸道和消化道感染，也可通过胎盘传给胎儿。感染公猪的精细胞、精索、附睾和副性腺均可分离出病毒，配种时易传给易感母猪。一旦发生本病后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁育失败。该病的发生给养猪业带来重大的经济损失，因此对于PPV感染的诊断和病猪的淘汰成为防治的重点。猪细小病毒(PPV)属细小病毒科细小病毒属，该病毒为单股线状负链DNA病毒，无囊膜，外观呈六角形或圆形，二十面体轴立体对称，核衣由32个壳粒组成。基因组大小约为。PPV目前只有一个血清型。PPV基因组为单股负链DNA，大小约5000bp，其中有2个主要开放阅读框，分别编码结构蛋白VP和非结构蛋白NS。近年来，国内外学者建立了血凝试验、血清中和试验，酶联免疫吸附试验，免疫荧光试验，普通PCR诊断，核酸探针，SYBRGreen实时荧光定量PCR等技术进行PPV的检测。普通PCR方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。但普通PCR诊断存在灵敏度较低这样的问题，且PPV亚临床感染猪群中病毒含量很低，普通PCR灵敏度较差，易造成漏检。专利技术内容本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的普通PCR检测猪细小病毒的缺陷，提供一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组及其应用，本专利技术所提供的巢式PCR引物组是针对猪细小病毒的结构蛋白VP2中碱基序列设计出的两对特异性引物，并且对多种病原菌进行验证，只有猪细小病毒可以扩增出特异条带，具有特异性。为了实现上述目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组，包括外侧引物PPV-O-F、PPV-O-R和内侧引物PPV-I-F、PPV-I-R；其中，所述外侧引物PPV-O-F的序列如SEQIDNO:1所示，所述外侧引物PPV-O-R的序列如SEQIDNO:2所示，所述内侧引物PPV-I-F的序列如SEQIDNO:3所示，所述内侧引物PPV-I-R如SEQIDNO:4所示。本专利技术另一方面提供了上述猪细小病毒巢式PCR引物组在检测猪细小病毒以及制备检测猪细小病毒试剂中的应用。在一种优选的实施方案中，采用上述巢式PCR引物组进行巢式PCR检测猪细小病毒的方法，包括如下步骤：1)将待测样本提取DNA得到样本DNA；2)将所述样本DNA进行两次PCR扩增，第一次PCR扩增采用外侧引物PPV-O-F与PPV-O-R，第二次PCR扩增采用内侧引物PPV-I-F与PPV-I-R；每次PCR产物进行电泳检测猪细小病毒。在一种优选的实施方案中，第一轮扩增的PCR反应体系包括：总体积为25μL，其中：金牌mix12.5μL，PPV-O-F与PPV-O-R各1μL，DNA模板1μL，ddH2O补足余量。在一种优选的实施方案中，第二轮扩增的PCR反应体系包括：总体积为25μL，其中：金牌mix12.5μL，PPV-I-F与PPV-I-R各1μL，以第一轮扩增产物为模板1μL，ddH2O补足余量。在一种优选的实施方案中，所述第一次PCR的反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。在一种优选的实施方案中，所述第一次PCR的反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。在一种优选的实施方案中，所述待测样本为小猪血清样本或脾脏、肺脏、初乳、精液、恶露的组织样本。在一种优选的实施方案中，第一次PCR扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测；第一次PCR扩增的目的条带为716bp。在一种优选的实施方案中，第二次PCR扩增后的产物进行电泳检测，出现286bp条带即可判断所述样品中存在猪细小病毒。通过上述技术方案，本专利技术所提供的巢式PCR检测引物组及检测方法是针对猪细小病毒的结构蛋白VP2中碱基序列设计出的两对特异性引物，并且对多种病毒病原进行扩增，只有猪细小病毒可以扩增出特异条带，具有特异性。本专利技术所提供的巢式PCR检测方法能从混合模板中扩增出特异性条带，显示检测方法抗干扰性较好。本专利技术的巢式PCR检测方法对现有流行毒株检测的最低拷贝数可达到101个数量级，最低拷贝数为100，比普通PCR检测方法灵敏度高3-5个数量级。附图说明图1为本专利技术实施例2巢式PCR外侧引物特异性检测的凝胶电泳图；图2为本专利技术实施例2巢式PCR内侧引物特异性检测的凝胶电泳图；图3为本专利技术实施例3巢式PCR外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图；图4为本专利技术实施例3巢式PCR内侧引物敏感性检测的凝胶电泳图；图5为本专利技术实施例3巢式PCR外侧引物干扰性检测的凝胶电泳图；图6为本专利技术实施例3巢式PCR内侧引物干扰性检测的凝胶电泳图。具体实施方式为了更好的理解上述技术方案，下面通过具体实施例对本申请技术方案做详细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互结合。应当理解的是，这里所使用的术语“和/或”包括其中一个或更多所列出的相关联项目的任意和所有组合。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。现有技术存在的普通PCR检测猪细小病毒的缺陷，本专利技术实施例的主要思路是：一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组，包括外侧引物PPV-O-F、PPV-O-R和内侧引物PPV-I-F、PPV-I-R；其中，所述外侧引物PPV-O-F的序列如SEQIDNO:1所示，所述外侧引物PPV-O-R的序列如SEQIDNO:2所示，所述内侧引物PPV-I-F的序列如SEQIDNO:3所示，所述内侧引物PPV-I-R如SEQIDNO:4所示。采用上述巢式PCR引物组进行巢式PCR检测猪细小病毒的方法，包括如下步骤：1)将待测样本提取DNA得到样本DNA；2)将所述样本DNA进行两次PCR扩增，第一次PCR扩增采用外侧引物PPV-O-F与PPV-O-R，第二次PCR扩增采用内侧引物PPV-I-F与PPV-I-R；每次PCR产物进行电泳检测猪细小病毒。本专利技术提供的巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、抗干扰性能好，且可靠性强，克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，而且与现有的间接免疫荧光、基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短，实用性强。另外，本专利技术实施例方法结果可靠，提取某养殖场多份血清样品，经过两轮巢式PCR扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组，其特征在于：包括外侧引物PPV‑O‑F、PPV‑O‑R和内侧引物PPV‑I‑F、PPV‑I‑R；其中，所述外侧引物PPV‑O‑F的序列如SEQ ID NO:1所示，所述外侧引物PPV‑O‑R的序列如SEQ ID NO:2所示，所述内侧引物PPV‑I‑F的序列如SEQ ID NO:3所示，所述内侧引物PPV‑I‑R如SEQ ID NO:4所示。

【技术特征摘要】
1.一种通用型猪细小病毒巢式PCR引物组，其特征在于：包括外侧引物PPV-O-F、PPV-O-R和内侧引物PPV-I-F、PPV-I-R；其中，所述外侧引物PPV-O-F的序列如SEQIDNO:1所示，所述外侧引物PPV-O-R的序列如SEQIDNO:2所示，所述内侧引物PPV-I-F的序列如SEQIDNO:3所示，所述内侧引物PPV-I-R如SEQIDNO:4所示。2.如权利要求1所述猪细小病毒巢式PCR引物组在检测猪细小病毒以及制备检测猪细小病毒试剂中的应用。3.根据权利要求2所述猪细小病毒巢式PCR引物组的应用，其特征在于：采用所述巢式PCR引物组进行巢式PCR检测猪细小病毒的方法，包括如下步骤：1)将待测样本提取DNA得到样本DNA；2)将所述样本DNA进行两次PCR扩增，第一次PCR扩增采用外侧引物PPV-O-F与PPV-O-R，第二次PCR扩增采用内侧引物PPV-I-F与PPV-I-R；每次PCR产物进行电泳检测猪细小病毒。4.根据权利要求3所述猪细小病毒巢式PCR引物组的应用，其特征在于：第一轮扩增的PCR反应体系包括：金牌mix12.5μL，PPV-O-F与PPV-O-R各1μL，DNA模板1μL，ddH2O补足余量；总体积为25μL。5.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国平，李文静，常小云，王家福，胡利群，刘满，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42