一种定量检测HBV核酸的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种定量检测HBV核酸的方法及试剂盒，具体地，本发明专利技术利用实时荧光聚合酶链式反应技术对HBV DNA核酸鉴别并且进行定量的检测试剂盒，可广泛应用于HBV病毒引起的乙型肝炎的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪，以及检验检疫和疫情防控等多个领域。

A Method and Kit for Quantitative Detection of HBV Nucleic Acid

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测HBV核酸的方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的方法及试剂盒。
技术介绍
乙肝病毒((hepatitisBvirus,HBV)是目前已知可导致病毒性肝炎的病毒之一。全世界HBV感染者达20多亿，其中3.5亿是慢性乙肝病毒携带者。慢性病毒携带者发生并发症的风险较高，并发症包括：慢性肝炎、肝硬化与肝细胞性肝癌。血清学标志物通常作为急性或慢性HBV感染的诊断和/或预后指标。HBV感染最常见的标志物是HBV表面抗原(HBsAg)。尽管病毒携带者可清除HBsAg，并形成抗HBsAg抗体，但依然具有发生严重肝脏并发症的风险。HBVe抗原(HBeAg)通常是作为进展性肝病相关，活动性HBV复制的次要标志物使用。HBeAg清除障碍患者，晚期肝病风险增加。HBV变异株可失去产生HBeAg的能力，即使是患者处于肝炎活动期，也可出现所产生的HBeAg无法被测出的情况。因此，通过该标志物检测，进行疾病进展监测，具有一定的局限性，有研究报道，血清HBVDNA检测具有急性、慢性HBV感染预后预测价值。使用该方法，可进行HBsAg清除后HBVDNA检测，或血清学标志物缺失情况下的HBV检测。然而，目前为止，还未确立血清学标志物与HBVDNA拷贝之间的关系。可通过血清学标志物与肝脏酶活性检测结果，对HBV感染患者抗病毒治疗疗效进行评估。但最直接，最可靠的病毒复制检测方法是血清或血浆HBVDNA定量测定。研究显示，α-干扰素，拉米夫定，甘昔洛韦、阿德福韦酯治疗患者HBVDNA拷贝的迅速、持续性下降，是理想治疗疗效的一种可预测性因素。通过HBVDNA拷贝检测，可对拉米夫定耐药情况进行预测。因此，HBVDNA定量检测是一种有价值的工具，可与其他血清学标志物联用，用于对HBV感染者的管理。可通过应用核酸扩增技术，如多聚酶链反应(PCR),对血清与血浆中的HBVDNA进行定量测定。乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)应用PCR技术，EDTA抗凝血清与血清HBVDNA定量测定动态范围与灵敏性非常高。乙肝五项检测并不能作为判断病毒是否复制的指标，而DNA检测通过扩增病毒核酸，对体内低水平的HBV病毒敏感，是判断病毒复制的常用手段。DNA是乙肝病毒感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标，HBVDNA阳性，提示HBV复制和有传染性，HBVDNA越高表示病毒复制越多，传染性越强。乙肝病毒的持续复制是乙肝致病的根本原因，HBV的治疗主要是进行抗病毒治疗，根本目的是抑制病毒复制，促使乙型肝炎病毒DNA的转阴。DNA检测对确诊HBV和评估HBV治疗效果也具有十分重要的作用，可了解机体内病毒的数量、复制水平、传染性、药物治疗效果、制定治疗策略等并作为评估指标，也是唯一能帮助确诊隐匿性HBV感染和隐匿性慢性HBV的实验室检测指标。目前市面上有很多公司均研发出通过实时荧光PCR定量检测血清或血浆HBV病毒核酸载量的试剂盒。乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)能准确检测的HBVDNA浓度最低检出限越低(95％确信率)，则灵敏度越高，越能及时检出HBV潜在感染者及对低水平HBV感染患者抗病毒治疗疗效进行有效评估，最低检出限仍然有可优化的空间。因此，本领域致力于开发灵敏度更高的HBV检测方法以满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高灵敏度、使用便捷的乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒及检测方法。本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的PCR引物对组，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQIDNO.:1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:2所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如SEQIDNO.:4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:5所示的反向引物。本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的探针组，所述探针组包括：如SEQIDNO.:3所示的针对乙型肝炎病毒S区基因保守序列的特异性的探针。在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQIDNO.:6所示的针对乙型肝炎病毒C区基因保守序列的特异性的探针。在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQIDNO.:7所示的内标探针。本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的试剂盒，所述试剂盒包括HBV反应液B，所述HBV反应液B包括本专利技术第一方面所述的PCR引物对组。在另一优选例中，所述HBV反应液B还包括本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒还包括HBV反应液A，所述HBV反应液A包括选自下组的一种或多种组分：热启动Taq酶、UDG酶和dNTPs。在另一优选例中，所述试剂盒还包括HBV定量参考品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括HBV强阳性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括HBV临界阳性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括内标质控品。本专利技术的第四方面，提供了一种检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测样本，所述样本中含有HBVDNA；(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应，绘制扩增曲线，并计算阈值循环值从而获得样本核酸的定量检测结果：其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、用于将待检测样本中HBVDNA进行扩增的PCR试剂、本专利技术第一方面所述的引物对组、和本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。本专利技术的第五方面，提供了本专利技术第一方面所述的引物对组、和本专利技术第二方面所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量。应理解，在本专利技术范围内，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1：20份灵敏度参考品PCR扩增曲线。图2：PCR扩增图。图3：标准曲线。图4:引物对1检测结果。图5：引物对2检测结果。图6：使用对照引物对3的多重检测结果。具体实施方式本专利技术属于病原体分子检测领域，涉及一种高灵敏度的人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA的检测试剂盒，具体涉及一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对HBVDNA核酸鉴别并且进行定量的检测试剂盒，可广泛应用于HBV病毒引起的乙型肝炎的窗口期检测、临床诊断、科学研究、疗效跟踪，以及检验检疫和疫情防控等多个领域。多重实时荧光PCR技术是将PCR技术和多色荧光标记探针相结合的先进技术，该方法具有快速、特异、灵敏、自动化程度高等特点，结合防污染技术处理，特别适合于大规模、快速诊断的需求。该技术采用不同荧光基团对特异性探针进行标记，配合多重PCR技术，可以在同一个PCR反应管中对多种类型的病毒同时进行扩增，荧光的增长信号与相应PCR产物的增长量成等比关系，并被自动化荧光检测仪收集，最后可通过分析荧光增长曲线达到检测病原体类型的目的。由于，荧光PCR技术具有扩增片段短，引物、探针具有双重特异等优点，因此，将多重实时荧光PCR技术应用于乙型肝炎病毒的快速检测，能提高检测鉴别效率，在短时间内判本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的PCR引物对组，其特征在于，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的PCR引物对组，其特征在于，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQIDNO.:1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:2所示的反向引物。2.如权利要求1所述的引物对组，其特征在于，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如SEQIDNO.:4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:5所示的反向引物。3.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的探针组，其特征在于，所述探针组包括：如SEQIDNO.:3所示的针对乙型肝炎病毒S区基因保守序列的特异性的探针。4.如权利要求3所述的探针组，其特征在于，所述探针组还包括：如SEQIDNO.:6所示的针对乙型肝炎病毒C区基因保守序列的特异性的探针；优选地，所述探针组还包括：如SEQIDNO.:7所示的内标探针。5.一种用于检测乙型肝炎病毒(HBV)的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括HBV反应液B，所述HBV反应液B包括权利要求1所述的PCR引物对组。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述HBV反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，夏乔，廖丽丽，李汉荣，杨鸿辉，韦思凤，唐康明，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44