检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。所述引物是检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物H7‑FP和H7‑RP，所述探针是检测H7N9亚型禽流感病毒强毒的探针H7‑HPProbe:和检测H7N9亚型禽流感病毒弱毒的探针H7‑LPProbe。本发明专利技术还公开了包括上述引物和探针的试剂盒。本发明专利技术可以特异性地检测H7亚型禽流感病毒并区分其强毒和弱毒，对其他亚型禽流感病毒或其他禽类病毒均无明显扩增曲线。单个反应系统可以同时检测出最低50拷贝每反应体系的H7亚型禽流感病毒弱毒的基因片段或50拷贝每反应体系的H7亚型禽流感病毒弱毒的基因片段。

One-step Real-time Fluorescence Quantitative PCR Primers, Probes and Kits for Detecting and Differentiating the Virulence of H7 Subtype Avian Influenza Virus

The invention relates to a one-step real-time fluorescence quantitative PCR primer, probe and kit for detecting and distinguishing the strong and weak virulence of H7 subtype avian influenza virus. The primer is a universal primer H7 FP and H7 RP for detecting the virulence of H7 subtype avian influenza virus. The probe is a probe H7 HPProbe for detecting the virulence of H7N9 subtype avian influenza virus and a probe H7 LPProbe for detecting the virulence of H7N9 subtype avian influenza virus. The invention also discloses a kit comprising the above primers and probes. The invention can specifically detect H7 subtype avian influenza virus and distinguish its strong and weak viruses, and has no obvious amplification curve for other subtypes of avian influenza virus or other avian viruses. A single reaction system can simultaneously detect the lowest 50 copies of avian influenza virus subtype H7 gene fragments per reaction system or 50 copies of avian influenza virus subtype H7 gene fragments per reaction system.

【技术实现步骤摘要】
检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒
本专利技术属于生命科学与生物
，涉及一种检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。本专利技术根据H7亚型禽流感病毒强毒和弱毒特有的保守基因序列，设计强弱毒通用的引物，并根据扩增片段中强毒和弱毒裂解位点处的不同序列模式设计分别检测强弱毒的探针，然后利用双通道荧光定量PCR技术进行检测，从而达到快速高通量检测H7亚型禽流感病毒并对毒力进行判断的目的，适用于H7亚型禽流感病毒的检测和流行病学监测。
技术介绍
流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分节段基因组的单股负链RNA病毒。流感病毒分为A、B、C三型。A型流感病毒抗原变异性最强，感染人和动物，常引起世界性大流行，多种禽类均可感染(YoonSW,WebbyRJ,WebsterRG:EvolutionandEcologyofInfluenzaAViruses.MicrobiologicalReviews1992,56(1):152-179.)。根据其包膜表面血凝素(Hemagglutinin)和神经氨酸酶(Neuraminidase)的抗原性分为若干亚型。H7N9亚型禽流感病毒自2013年在我国被报道以来，已经形成了五波流行高峰，截至2018年9月5日，世界卫生组织WHO共报道了1567例人感染H7N9病例，死亡率高达40％。在五波流行高峰中，首次在人感染病例样本中分离到了裂解位点具有多个氨基酸插入的新型H7N9突变株，提示高致病性H7N9病毒的出现，与此同时，2016年底至2017年初，在广东省活禽市场收集的样本中也检测到类似的H7N9突变株，经动物实验研究表明这些病毒对鸡具有高致病性(LiuD,ZhangZ,HeL,etal.Characteristicsoftheemergingchicken-originhighlypathogenicH7N9viruses:Anewthreattopublichealthandpoultryindustry.JournalofInfection,2017,76(2))。在活禽市场发现高致病性H7N9病毒后不久，养鸡场同样也发现了该病毒，并在多个养殖场爆发了严重的疫情。研究已证实，携带病毒的家禽是人感染禽流感病毒的传染源，人感染H7N9病毒的途径则是人类通过直接接触带毒家禽或被其排泄物污染环境而感染，而高致病性H7N9禽流感病毒在出现及流行后不久，也逐渐获得了对哺乳动物毒力增强的趋势。我国拥有密度非常高的活禽交易市场(Livepourltrymarket，LPM)，这样的大环境给H7N9亚型禽流感病毒的流通、增殖以及传播提供了优良的环境，同时也增加了人类与禽类之间的频繁接触。因此，监测禽群中的H7N9成了防控该疾病的首要任务，快速检测方法的建立是H7N9防控的必要手段。官方推荐快速检测H7N9病毒的方法是核酸检测，国家卫计委和中国动物疫病控制中心都采用的是WHO和OIE推荐的实时逆转录荧光定量PCR(Real-timereversetranscriptasepolymerasechainreaction,RRT-PCR)。其他检测方法亦有报道，如胶体金免疫层析法、基因芯片、免疫传感器、免疫荧光法、ELISA法等也被广泛用于禽流感病毒检测(PengD,HuS,HuaY,etal.Comparisonofanewgold-immunochromatographicassayforthedetectionofantibodiesagainstavianinfluenzaviruswithhemagglutinationinhibitionandagargelimmunodiffusionassays.VeterinaryImmunology&Immunopathology,2007,117(1-2):17.)。然而，其中一些方法不能对禽流感病毒进行亚型分类，或者灵敏度不足因此不能用于早期诊断和病毒筛查。RRT-PCR是一种具有高度特异性和灵敏度的方法，但当前市场上检测流感病毒常用的RRTPCR探针多为Taqman-LNA型探针、FRET探针等等。目前在H7N9病毒鉴定过程中所选用的RRT-PCR试剂盒通常是选用HA和NA基因的保守区域作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，对H7N9禽流感病毒进行定性检测，不能区分强弱毒。而当前H7N9亚型禽流感病毒强弱毒共存，有必要建立能够区分强弱毒的RRT检测方法，对有效监测H7N9的流行情况很有必要。MGB基团是新一代猝灭基团。MGB探针3′端的猝灭基团取代传统的TAMRA后自身不发光，荧光本底降低，改善了荧光光谱分辨率(MingxiaoM,JinhuaL,YingjinS,LiL,YongfeiL:TaqManMGBprobefluorescencereal-timequantitativePCRforrapiddetectionofChineseSacbroodvirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.)。Taqman-MGB探针是在TaqMan探针的3’端偶联结了小沟结合物(Minorgroovebinding,MGB)，它可以缩短探针长度，提高探针Tm值，增强探针与模板的结合，并实现分辨一个碱基的差异(MaM,LiuJ,SongY,LiL,LiY:TaqManMGBProbeFluorescenceReal-TimeQuantitativePCRforRapidDetectionofChineseSacbroodVirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.,SahaR,DonofrioRS,BagleyST:Quantitativereal-timePCRdetectionofPseudomonasoleovoranssubsp.lubricantisusingTaqMan-MGBassayincontaminatedmetalworkingfluids.InternationalBiodeterioration&Biodegradation2011,65(3):460-464)，因此在SNP检测、病原体检测方面都有应用。本试剂盒用两条MGB探针及同一对引物进行H7AIV强弱毒的检测和区分，有较高的灵敏性、特异性，一次可以同时分析近百个样本，在H7亚型禽流感病毒早期快速检测并区分强弱毒方面具有很好的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种一步法实时荧光定量PCR试剂盒，用于同时检测并区分H7亚型禽流感病毒强毒和弱毒。由于是直接检测病原体核酸，因此具有高敏感、高特异和短检测窗口期等优点，能为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间，为H7亚型禽流感病毒监测提供技术支撑。本专利技术用于检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物和探针如下：(1)检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物：H7-FP:GCCATTTCAGAACATAGATAGCAG(SEQIDNo.1)H7-RP:GCCTTCCCATCCATTTTCAAT(SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物及探针，其特征在于，所述引物及探针是：(1)检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物：H7‑FP:GCCATTTCAGAACATAGATAGCAGH7‑RP:GCCTTCCCATCCATTTTCAAT(2)检测H7N9亚型禽流感病毒强毒的探针：H7‑HPProbe:FAM‑CCTCTCGCARTCCGTTT‑MGB(3)检测H7N9亚型禽流感病毒弱毒的探针：H7‑LPProbe:VIC‑TAGGCCTCTTCCCTTTG‑MGB。

【技术特征摘要】
1.用于检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物及探针，其特征在于，所述引物及探针是：(1)检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物：H7-FP:GCCATTTCAGAACATAGATAGCAGH7-RP:GCCTTCCCATCCATTTTCAAT(2)检测H7N9亚型禽流感病毒强毒的探针：H7-HPProbe:FAM-CCTCTCGCARTCCGTTT-MGB(3)检测H7N9亚型禽流感病毒弱毒的探针：H7-LPProbe:VIC-TAGGCCTCTTCCCTTTG-MGB。2.一种检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒组成是：(1)A液：12.5x酶Mix：包括1U/μL的热启动TaqDNA聚合酶、7U/μL的RNase抑制剂、100U/μL的反转录酶；(2)B液：5xPCR缓冲液：包括5mMdNTP、12mMMgCl2、TaqBuffer；(3)C液：引物Mix:包括10μMH7-F...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀梵，刘东，张竹君，何丽红，刘娇，石磊，胡娇，顾敏，刘晓文，王晓泉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32