检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法技术

本发明专利技术提供了检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法及在病毒(特别具有高变异性的RNA病毒)检测中的引用；本发明专利技术涉及不具有3’→5’外切酶校正功能的DNA聚合酶(非高保真DNA聚合酶)和具有3’→5’外切酶校正功能的高保真DNA聚合酶，当无错配时在非高保真DNA聚合酶作用下驱动引物延伸，形成DNA产物。当引物3’端与模板存在错配的情况下，高保真DNA聚合酶切除引物3’端错配碱基，普通DNA聚合酶负责催化DNA合成；本发明专利技术方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简单、方便快捷，可广泛用于病毒检测等相关领域。

Real-time quantitative fluorescence polymerase chain reaction for detection of mismatch tolerance of multiple pathogens

The present invention provides a real-time fluorescence quantitative PCR method for detecting mismatch tolerance of multiple pathogens and a reference in virus detection (especially RNA viruses with high variability); the present invention relates to DNA polymerase (non-high fidelity DNA polymerase) without 3'5'exonuclease correction function and high fidelity DNA polymerase with 3'5' exonuclease correction function, and non-high fidelity DN without mismatch. A-polymerase drives primers to extend and form DNA products. When there is mismatch between primer 3'end and template, high fidelity DNA polymerase excises primer 3' end mismatch base, and common DNA polymerase is responsible for catalyzing DNA synthesis. The method has good specificity, high sensitivity, good repeatability, simple operation, convenience and rapidity, and can be widely used in virus detection and other related fields.

【技术实现步骤摘要】
检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法
本专利技术涉及核酸检测
，具体来说是涉及检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法。
技术介绍
传染病病毒检测是新发突发传染病防控的关键，快速准确的检测对于预防、治疗和控制尤其关键。目前实验室检测病毒的主要方法有病毒分离法、血清抗体检测和核酸检测等。病毒分离法需要特定的实验条件和人员，实验周期长，仅限于特殊目的及用途，是目前广泛采用的快速检测标准方法；血清抗体检测操作相对简单，但灵敏度较低，受干扰因素较多，需结合其他检测结果才能确诊；核酸检测是一种新型的检测方法，它通过PCR等手段检测病毒感染过程中所产生的核酸，不仅检测时间较早，且耗时较短，其灵敏度高于上述2种方法，特异性较高。目前，实时荧光定量RT-PCR(Real-TimeRT-PCR)是较为常用的一种检测方法，分为染料法和探针法。然而，因病毒和细菌等微生物种类多，变异快，样品中会存在大量变异体(variants)，故易发生引物和模板之间的错配，导致检测结果的错误(如假阳性、假阴性)。为了检测多种类的病毒或同一种类病毒的不同病毒亚型，毒株或者变异体，常常需要分别进行测试，因此增加了检测难度并费时费力。基于此，本领域迫切需要开发简便、快速、灵敏、准确地检测高变异病毒的核酸扩增方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)以待测基因为模板，用M种引物对和M种探针(或荧光染料)，以高保真DNA聚合酶、非高保真DNA聚合酶和逆转录酶混合酶进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，M为≥1的正整数；2)根据野生型基因序列设计正向引物、探针和反向引物，对探针进行5’-，3’-末端的荧光基团和淬灭基团标记；3)用步骤2)中所述正向引物、探针和反向引物对待测基因进行(RT-或实时荧光定量)PCR扩增反应；当正向或反向引物与模板(野生型)完全互补配对时，高保真DNA聚合酶对正向引物进行3’-5’校对，启动DNA合成；当正向或反向引物与模板(突变型)不完全匹配时，高保真DNA聚合酶也将发挥其3’-5’校对功能，识别正向或反向引物的3’末端错配碱基为错配信号，利用其3’-5’外切酶活性，切除3’末端错配碱基，从而进行DNA合成(即PCR扩增)。4)通过实时荧光(RT-)PCR扩增曲线的阈循环数比较或电泳检测扩增产物，从而获得定量或定性的检测结果，即是否存在特定病毒基因。作为优选的技术方案，所述正向引物、反向引物和探针均与野生型序列相对应区段上的碱基序列完全匹配，以正向引物或反向引物3’末端碱基起第1-8位任意一个或多个碱基位点对应突变模板中的突变碱基位点。作为优选的技术方案，所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团，或者3’端标记荧光报告基团，5’端标记荧光猝灭基团。作为优选的技术方案，所述步骤(1)中M为1-50，M种引物对中≥80％，≥90％或100％是位点特异性引物对。作为优选的技术方案，所述荧光基团选自下组：FAM、Cy5、TexasRed、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LCRed610、LCRed640、LCCyan500、YakimaYellow，所述猝灭基团选自下组：BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2、Dabcyl。作为优选的技术方案，所述荧光染料选用SYBRGreenI和SYTO9。作为优选的技术方案，所述步骤4)中除了采用高保真DNA聚合酶之外，还同时添加或使用少量非高保真DNA聚合酶，例如无3’-5’外切酶活性的普通耐热DNA聚合酶。作为优选的技术方案，所述高保真DNA聚合酶具有3’-5’外切酶活性，没有5’-3’外切酶活性；所述非高保真DNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，没有3’-5’外切酶活性；二者要联合使用。作为优选的技术方案，所述高保真DNA聚合酶包括：Q5DNA聚合酶、KODplusneoDNA聚合酶、BlendTaqDNA聚合酶、PromstarHSDNA聚合酶或其组合；非高保真DNA聚合酶包括：TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶或其组合。作为优选的技术方案，所述高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶比例为(0.05-0.5)：1；较佳的为(0.1-0.3):1；更佳的为(0.15-0.2):1。通常，高保真DNA聚合酶的用量为非高保真DNA聚合酶用量的1/5或更低，正常扩增体系中非高保真DNA聚合酶需要加入2.5U/25μl,高保真DNA聚合酶只需要加入0.15U-0.3U/25μl。进一步，本专利技术可以对核酸进行有效定量和检测，其探针不与模板错配，本专利技术在这里使用的是普通荧光定量中TaqMan探针。本专利技术的有益效果为：(1)与现有所有应用于病原微生物核酸检测方法相比，在检测病原微生物(主要是病毒)的核酸检测过程中检测操作简便快捷，检测结果准确可靠。(2)对于高变异病毒的检测能够更好的设计引物，解决了病毒高变异区域难以设计合适引物的问题，对于流行病的检测(特别是RNA病毒)有非常大的便利性。(3)本专利技术可广泛用于诊断和非诊断性的检测，并且可用于耐药、抗突变的检测；同时也可以针对食品、病原微生物(细菌、病毒等)的检测。附图说明图1显示了联合使用高保真和非高保真DNA聚合酶和普通上下游引物抗突变检测的原理图；图2显示了本专利技术实施例1中基于普通引物对、少量高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶对RSV野生型模板和突变型模板的检测；图3显示了本专利技术实例2中基于博卡病毒上游引物3’端突变引物、少量高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶对博卡野生型模板的检测；具体实施方式首先，本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可简便、快速、灵敏地检测高变异的RSV病毒的方法。具体地，本专利技术人利用高保真DNA聚合酶的3’-5’外切酶校正功能以及特定的优化条件，开发了一种操作简单快捷、灵敏性强、准确度高的检测方法。实验表明，本专利技术方法可广泛用于诊断和非诊断性的检测，并且可用于检测各种不同的病原体，如细菌、病毒等，尤其高变异性的病原体微生物。在此基础上完成了本专利技术。术语如本文所用，碱基的“匹配”或“配对”是指两条核苷酸序列中相应的碱基按照A与T，G与C配对的原则形成反向互补的双链结构。如本文所用，本文所用“完全匹配”是指引物与模板之间序列完全互补，不存在任何碱基错配。探针探针是一种寡核苷酸序列，与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，探针5’端一般连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，呈现一种S型曲线。本专利技术中用的是普通荧光定量中TaqMan探针。高保真DNA聚合酶在本专利技术中，一个重要的特征是采用少量高保真DNA聚合酶。如本文所用，“高保真DNA聚合酶”指具有识别发生错配的“引物-模板”复合物并从所述复合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)以待测基因为模板，用M种引物对和M种探针(或荧光染料)，以高保真DNA聚合酶、非高保真DNA聚合酶和逆转录酶混合酶进行实时荧光RT‑PCR扩增，其中，M为≥1的正整数；2)根据野生型基因序列设计正向引物、探针和反向引物，对探针进行5’‑，3’‑末端的荧光基团和淬灭基团标记；3)用步骤2)中所述正向引物、探针和反向引物对待测基因进行(RT‑或实时荧光定量)PCR扩增反应；当正向或反向引物与模板(野生型)完全互补配对时，高保真DNA聚合酶对正向引物进行3’‑5’校对，启动DNA合成；当正向或反向引物与模板(突变型)不完全匹配时，高保真DNA聚合酶也将发挥其3’‑5’校对功能，识别正向或反向引物的3’末端错配碱基为错配信号，利用其3’‑5’外切酶活性，切除3’末端错配碱基，从而进行DNA合成(即PCR扩增)。4)通过实时荧光(RT‑)PCR扩增曲线的阈循环数比较或电泳检测扩增产物，从而获得定量或定性的检测结果，即是否存在特定病毒基因。

【技术特征摘要】
1.检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)以待测基因为模板，用M种引物对和M种探针(或荧光染料)，以高保真DNA聚合酶、非高保真DNA聚合酶和逆转录酶混合酶进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，M为≥1的正整数；2)根据野生型基因序列设计正向引物、探针和反向引物，对探针进行5’-，3’-末端的荧光基团和淬灭基团标记；3)用步骤2)中所述正向引物、探针和反向引物对待测基因进行(RT-或实时荧光定量)PCR扩增反应；当正向或反向引物与模板(野生型)完全互补配对时，高保真DNA聚合酶对正向引物进行3’-5’校对，启动DNA合成；当正向或反向引物与模板(突变型)不完全匹配时，高保真DNA聚合酶也将发挥其3’-5’校对功能，识别正向或反向引物的3’末端错配碱基为错配信号，利用其3’-5’外切酶活性，切除3’末端错配碱基，从而进行DNA合成(即PCR扩增)。4)通过实时荧光(RT-)PCR扩增曲线的阈循环数比较或电泳检测扩增产物，从而获得定量或定性的检测结果，即是否存在特定病毒基因。2.根据权利要求1所述的检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法，其特征在于：所述正向引物、反向引物和探针均与野生型序列相对应区段上的碱基序列完全匹配，以正向引物或反向引物3’末端碱基起第1-8位任意一个或多个碱基位点对应突变模板中的突变碱基位点。3.根据权利要求2所述的检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法，其特征在于：所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团，或者3’端标记荧光报告基团，5’端标记荧光猝灭基团。4.根据权利要求3所述的检测多种病原体的错配耐受荧光实时定量PCR方法，其特征在于：所述步骤(1)中M为1-50，M种引物对中≥80％，≥90...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔红兵，
申请(专利权)人：南京迈维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32