【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法，借助crispr-cas9技术构建的表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，属于基因工程。
技术介绍
1、禽流感病毒感染严重制约国内外养禽业的持续健康发展。同时，部分亚型禽流感病毒可跨宿主感染哺乳动物，包括人类，对公共卫生安全造成严重威胁。h10亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒都是中国急需免疫防控的两种重要的家禽新发病毒疫病。本专利技术以血清4型禽腺病毒为载体，将h10n3禽流感病毒的ha基因替换血清4型禽腺病毒的fiber-2基因，成功构建了表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，为联合防控血清4型禽腺病毒和h10n3禽流感病毒提供了二联候选疫苗毒株。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就在于克服上述缺陷，提供一种表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒；其特征是：为基于crispr-cas9技术表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒；
3、所述的h10n3禽流感病毒ha蛋白，其序列如seq id no.1所示；
4、所述的重组血清4型禽腺病毒，其中使用h10n3禽流感病毒ha基因替换血清4型禽腺病毒fiber-2基因，替换的是
5、表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒的构建方法，该制备方法包括以下步骤：
6、(1)利用sgrna在线设计网站设计针对血清4型禽腺病毒fiber-2基因的sgrna，其序列如表1所示；
7、表1针对fiber-2基因的sgrna序列
8、
9、(2)通过pcr和同源重组的方法构建携带h10n3禽流感病毒ha基因和rfp表达盒的供体质粒，其中rfp表达盒两端都带有loxp位点，pcr使用的引物序列如表2所示；
10、表2构建供体质粒所用的pcr引物
11、
12、(3)6孔板接种lmh细胞培养过夜，共转染sgrna和供体质粒各3μg，转染6h后去除转染上清并加培养液；转染12h后感染表达egfp的重组4型腺病毒(fa4-egfp)，感染2h后换成细胞维持液；
13、(4)感染fa4-egfp后观察rfp红色荧光，利用空斑试验和有限稀释的方法进行红色荧光重组病毒的纯化，获得带有rfp表达盒的表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒；
14、(5)纯化后的红色荧光重组病毒接种转染cre重组酶的lmh细胞，4d后取感染的细胞上清再次接种转染cre重组酶的lmh细胞，重复该过程直至红色荧光病毒完全消失；使用pcr、i fa和western blot的方法对去除rfp表达盒的表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒进行鉴定。
15、表达egfp的重组病毒fa4-egfp，其特点是能够表达绿色荧光egfp，区别于重组病毒的红色荧光蛋白rfp，便于快速纯化重组病毒，重组病毒fa4-egfp的详细构建方法见专利cn112877303a。
16、本专利技术方法先进科学，通过本专利技术，基于crispr-cas9技术构建表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，本专利技术的关键技术是利用crispr-cas9技术在血清4型禽腺病毒中插入h10n3禽流感病毒ha基因以及带有loxp位点的rfp表达盒，利用rfp蛋白进行病毒的纯化，纯化完成后使用cre重组酶敲除rfp表达盒，最后获得可以表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒。
17、本专利技术利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入h10n3禽流感病毒ha基因，成功获得了表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，此重组病毒可作为h10n3以及血清4型腺病毒二联疫苗候选株。
18、本专利技术构建的表达h10n3禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，为制备血清4型禽腺病毒和h10n3禽流感病毒二联疫苗奠定了基础。因此，本专利技术具有一定的市场应用价值。
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1.一种表达H10N3禽流感病毒禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒；其特征是：为基于CRISPR-Cas9技术表达H10N3禽流感病毒禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒；
2.如权利要求1所述的表达H10N3禽流感病毒禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒的构建方法，其特征是：该制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2中所述的制备方法，其特征是：表达EGFP的重组病毒FA4-EGFP，其特点是能够表达绿色荧光EGFP，区别于重组病毒的红色荧光蛋白RFP，便于快速纯化重组病毒。
【技术特征摘要】
1.一种表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒；其特征是：为基于crispr-cas9技术表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒；
2.如权利要求1所述的表达h10n3禽流感病毒禽流感病毒ha蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤也，汤婷，万志敏，蒋蕙如，刘时，姜文杰，马也，聂雨晴，谢泉，李拓凡，叶建强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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