一种检测莴苣坏死黄化病毒的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法。试剂盒主要包括LNYV抗体IgG、RT反向引物LNYV‑R、LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；本发明专利技术特异性强，灵敏度达到了3.5 pg/mL，比普通PCR高100倍，且无需提取RNA，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，为LNYV的检测提供了新的技术平台，可用于监控生菜LNYV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

An IC-RT-LAMP kit for detection of lettuce necrotizing and yellowing virus and its detection method

The invention discloses an IC RT LAMP kit for detecting lettuce necrotizing yellowing virus LNYV and a detection method thereof. The kit mainly includes LNYV antibody IgG, RT reverse primer LNYV R, LAMP primer group, first-chain DNA synthesis reagent, LAMP amplification reaction reagent, fluorescent dye detection solution, negative control and positive control substance; the specificity of the kit is strong, the sensitivity is up to 3.5 pg/mL, 100 times higher than ordinary PCR, and no RNA extraction and professional equipment are needed, which simplifies the operation process. It reduces the detection difficulty and improves the detection efficiency. It provides a new technical platform for LNYV detection. It can be used to monitor the occurrence, spread and spread of lettuce LNYV virus, and is suitable for popularization and application at the grass-roots level.

【技术实现步骤摘要】
一种检测莴苣坏死黄化病毒的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。
技术介绍
生菜(Lactucasativa)属菊科莴苣种的叶用类型，别名鹅仔菜、莴仔菜，属一年生和二年生蔬菜，是具有很高营养价值的蔬菜之一，也是深受我国人民喜爱的蔬菜之一。近年来，生菜越来越受到人们的喜欢，特别是发现它的一些功效后，生菜的种植面积逐渐扩大，同时，种植户也面临着一系列病害问题，其中病毒病是比较常见的病害，分布广泛；露地种植危害重，发病率高达60%，甚至更高。病毒侵染生菜后，破坏生菜的养分疏通通道，改变生菜器官或打乱组织代谢平衡，抑制光合作用。植株在幼苗期发病影响较大，主要表现出花叶斑驳状，同时叶片皱缩、歪扭，还有可能出现明脉，在严重的时候还会出现不规则灰褐色坏死斑；成株发病，叶片皱缩，叶面泡状突起很不平整，植株的生长受到抑制，出现明显的矮缩，甚至叶脉变成褐色或出现褐色坏死斑，严重影响着品质和产量。近年来，植物病毒侵染导致生菜大面积受害现象越来越严重，文献报道的感染生菜的主要病毒有马铃薯病毒属的马铃薯S病毒（PotatovirusS,PVS）、马铃薯Y病毒属的莴苣花叶病毒(Lettucemosaicvirus,LMV)、蒲公英黄花叶病毒（Dandelionyellowmosaicvirus,DYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）等。2018年，中国科学院寒区旱区环境与工程研究所植物病毒研究组在甘肃兰州地区的生菜田里发现了一种新的感染生菜的植物病毒-莴苣坏死黄化病毒（Lettucenecroticyellowsvirus,LNYV）。LNYV为细胞质弹状病毒属的典型成员，病毒粒子呈弹状或多形状，经过固定后大多为杆菌状，长200-350nm，直径70-95nm，病毒核酸为单分子线形负义ssRNA，长11-15kb，蛋白质包含5种结构蛋白，分别为蛋白L（分子质量160-180kDa）、蛋白G（78kDa）、蛋白N（57kDa）、蛋白NS（38kDa）和蛋白M（19kDa）。LNYV的寄主限于藜科、菊科、豆科、百合科和茄科的一些植物，蚜虫是其主要的传播介体，LNYV早先在澳大利亚和新西兰有报道；此次在兰州生菜上检测到的LNYV为国内首次报道。对于LNYV在我国生菜中分布、感病率以及对我国生菜的影响等基本信息，目前都不清楚。解决以上问题，急需开发一种特异、灵敏、实用且易于推广的分子检测技术。目前国际上针对LNYV的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），但这两种方法都存在一些缺陷。ELISA法的灵敏度不够高，易出现非特异性反应，还必须依赖酶标仪等专业设备；RT-PCR方法检测特异性强、灵敏度高、但与本专利技术相比，需要提取高质量的RNA，操作复杂，所需试剂昂贵，对检测人员的技术水平要求高，除此之外，还必须依赖PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备，推广普及受到很大限制。相比之下，DNA环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上多个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BstDNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。与常规检测的PCR方法相比，LAMP技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。本专利技术将免疫捕获IC与LAMP技术有机结合，成功建立了IC-RT-LAMP技术特异检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的方法。IC-RT-LAMP结合了血清学和LAMP两种方法的优点，不用提取RNA，操作简便、特异性强、灵敏度达到了3.5pg/mL，比普通PCR高100倍，且检测成本低、不需要PCR仪等分子生物学仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接观测，非常适合生菜等蔬菜病毒的检测，为LNYV的有效防治提供可靠的技术依据。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中莴苣坏死黄化病毒LNYV检测方法操作复杂、对操作人员技术水平要求高、所需仪器设备昂贵等问题，本专利技术的目的是提供一种莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP特异性检测引物组合物；本专利技术的另一目的是提供上述莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测试剂盒；本专利技术的另一目的是提供上述莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测引物组合物：由RT反向引物LNYV-R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：LNYV-R：5’-ATACCATGCCGCGAATCTGT-3’；F3：5’-ACCTAAGCCAGCAATGACAT-3’；B3：5’-TGCCCAATCCAGCCTCTT-3’；FIP：5’-CTGTTAGATACTCCCGCCTGCGACACCTCCTAACACCTCCTT-3’；BIP：5’-CTCTGGACGCAACCCGGAAGATTGCTTCGTACCTAGCCCT-3’；LF：5’-CGAGCCTAGTACCTTGATCTGAAG-3’；LB：5’-AATTTGTTGACTGAGACTGATGAGG-3’。所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物在检测莴苣坏死黄化病毒中的应用。一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP试剂盒，包括LNYV抗体IgG、RT反向引物LNYV-R、LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，其中特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，上述特异性RT反向引物LNYV-R以及LAMP引物组的序列如下：LNYV-R：5’-ATACCATGCCGCGAATCTGT-3’；F3：5’-ACCTAAGCCAGCAATGACAT-3’；B3：5’-TGCCCAATCCAGCCTCTT-3’；FIP：5’-CTGTTAGATACTCCCGCCTGCGACACCTCCTAACACCTCCTT-3’；BIP：5’-CTCTGGACGCAACCCGGAAGATTGCTTCGTACCTAGCCCT-3’；LF：5’-CGAGCCTAGTACCTTGATCTGAAG-3’；LB：5’-AATTTGTTGACTGAGACTGATGAGG-3’。除此之外，所述第一链cDNA合成试剂由10mMdNTPs、5×M-M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC‑RT‑LAMP检测引物组合物，其特征在于：由RT反向引物LNYV‑R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：LNYV‑R：5’‑ATACCATGCCGCGAATCTGT ‑3’；F3：5’‑ ACCTAAGCCAGCAATGACAT ‑3’；B3：5’‑ TGCCCAATCCAGCCTCTT ‑3’；FIP：5’‑ CTGTTAGATACTCCCGCCTGCGACACCTCCTAACACCTCCTT ‑3’；BIP：5’‑ CTCTGGACGCAACCCGGAAGATTGCTTCGTACCTAGCCCT ‑3’；LF：5’‑ CGAGCCTAGTACCTTGATCTGAAG ‑3’；LB：5’‑ AATTTGTTGACTGAGACTGATGAGG ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测引物组合物，其特征在于：由RT反向引物LNYV-R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：LNYV-R：5’-ATACCATGCCGCGAATCTGT-3’；F3：5’-ACCTAAGCCAGCAATGACAT-3’；B3：5’-TGCCCAATCCAGCCTCTT-3’；FIP：5’-CTGTTAGATACTCCCGCCTGCGACACCTCCTAACACCTCCTT-3’；BIP：5’-CTCTGGACGCAACCCGGAAGATTGCTTCGTACCTAGCCCT-3’；LF：5’-CGAGCCTAGTACCTTGATCTGAAG-3’；LB：5’-AATTTGTTGACTGAGACTGATGAGG-3’。2.权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物在检测莴苣坏死黄化病毒LNYV中的应用。3.一种采用如权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP试剂盒，所述试剂盒由LNYV抗体IgG、权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂组成；其特征在于：所述试剂盒还包括LNYV抗体IgG包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBRGreenI荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品为ddH2O；所述阳性对照品为生菜LNYV蛋白N基因标准品；所述阳性对照品序列如下：生菜LNYV蛋白N基因标准品：CGCCAAAGAAGGATAAAGGGAAGGGACCTGAATCCTCGAACACACAAGATGACAATCAGTTGGCGCAAGCAAGCAAAGACAGAGATATTGATATGGGCACTAGTGGCACATTTGCTGTACCTAGATACAAGATTTTTAAATCCAAATTGAGGTTCCCAATGGTTAGGGGCAGGAAGATTATGAATATGAGCCACCTCGCACAATATAACCCAGAGCAGACAGATCTAGCCAACACAAGAGCAACACAGAATCAGTTTGCTCGATGGTTCGACGGCATCAAAGGAGATTATGGTCTGAATGATGCGGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉宝，王亚军，谢忠奎，郭志鸿，邱阳，何玉惠，
申请(专利权)人：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62