一种特异性检测生菜LNYV病毒的IC-RT-LAMP 检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC‑RT‑LAMP检测方法，其步骤主要包括用LNYV的抗体IgG特异性捕获LNYV病毒粒子，利用LNYV的特异性引物进行反转录RT反应合成cDNA，再利用特异性的LAMP引物组进行LAMP扩增，反应结束后用荧光染料肉眼观察法或琼脂糖凝胶电泳检测待检样品是否含有LNYV。本发明专利技术特异性强，灵敏度达到了3.5 pg/mL，比普通PCR高100倍，且无需提取RNA，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率，为生菜LNYV的分子检测提供了新的技术平台，可用于监控LNYV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

An IC-RT-LAMP Method for Specific Detection of Lettuce LNYV Virus

The invention discloses an IC RT LAMP detection method for the specific detection of lettuce necrotizing yellowing virus LNYV. The steps mainly include the specific capture of LNYV virus particles with LNYV antibody IgG, reverse transcription RT reaction with LNYV specific primers to synthesize DNA, LAMP amplification with specific LAMP primers, naked eye observation with fluorescent dyes or agarose after reaction. Gel electrophoresis was used to detect whether the sample contained LNYV. The invention has strong specificity, high sensitivity of 3.5 pg/mL, 100 times higher than ordinary PCR, does not need to extract RNA and professional equipment, simplifies the operation process, reduces the detection difficulty and improves the detection efficiency, provides a new technical platform for the molecular detection of lettuce LNYV, can be used to monitor the occurrence, spread and prevalence of LNYV virus, and is suitable for popularization and application at the grass-roots level. \u3002

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测生菜LNYV病毒的IC-RT-LAMP检测方法
本专利技术涉及一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。
技术介绍
生菜(Lactucasativa)属菊科莴苣种的叶用类型，别名鹅仔菜、莴仔菜，属一年生和二年生蔬菜，是具有很高营养价值的蔬菜之一，也是深受我国人民喜爱的蔬菜之一。近年来，生菜越来越受到人们的喜欢，特别是发现它的一些功效后，生菜的种植面积逐渐扩大，同时，种植户也面临着一系列病害问题，其中病毒病是比较常见的病害，分布广泛。露地种植危害重，发病率高达60%，甚至更高。病毒侵染生菜后，破坏生菜的养分疏通通道，改变生菜器官或打乱组织代谢平衡，抑制光合作用。植株在幼苗期发病影响较大，主要表现出花叶斑驳状，同时叶片皱缩、歪扭，还有可能出现明脉，在严重的时候还会出现不规则灰褐色坏死斑。成株发病，叶片皱缩，叶面泡状突起很不平整，植株的生长受到抑制，出现明显的矮缩，甚至叶脉变成褐色或出现褐色坏死斑，严重影响着品质和产量。近年来，植物病毒侵染导致生菜大面积受害现象越来越严重，文献报道的感染生菜的主要病毒有马铃薯病毒属的马铃薯S病毒（PotatovirusS,PVS）、马铃薯Y病毒属的莴苣花叶病毒(Lettucemosaicvirus,LMV)、蒲公英黄花叶病毒（Dandelionyellowmosaicvirus,DYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）等。2018年，中国科学院寒区旱区环境与工程研究所植物病毒研究组在甘肃兰州的生菜田里发现了一种新的感染生菜的植物病毒-莴苣坏死黄化病毒（Lettucenecroticyellowsvirus,LNYV）。LNYV为细胞质弹状病毒属的典型成员，病毒粒子呈弹状或多形状，经过固定后大多为杆菌状，长200-350nm，直径70-95nm，病毒核酸为单分子线形负义ssRNA，长11-15kb，蛋白质包含5种结构蛋白，分别为蛋白L（分子质量160-180kDa）、蛋白G（78kDa）、蛋白N（57kDa）、蛋白NS（38kDa）和蛋白M（19kDa）。LNYV的寄主限于藜科、菊科、豆科、百合科和茄科的一些植物，蚜虫是其主要的传播介体，LNYV早先在澳大利亚和新西兰有报道。此次在兰州生菜上检测到的LNYV为国内首次报道。对于LNYV在我国生菜中分布、感病率以及对我国生菜的影响等基本信息，目前都不清楚。解决以上问题，急需开发一种特异、灵敏、实用且易于推广的分子检测技术。目前国际上针对LNYV的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），但这两种方法都存在一些缺陷。ELISA法的灵敏度不够高，易出现非特异性反应，还必须依赖酶标仪等专业设备；RT-PCR方法检测特异性强、灵敏度高、但与本专利技术相比，需要提取高质量的RNA，操作复杂，所需试剂昂贵，对检测人员的技术水平要求高，除此之外，还必须依赖PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备，推广普及受到很大限制。相比之下，DNA环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上多个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BstDNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。与常规检测的PCR方法相比，LAMP技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。本专利技术将免疫捕获IC与LAMP技术有机结合，成功建立了IC-RT-LAMP技术特异检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的方法。IC-RT-LAMP结合了血清学和LAMP两种方法的优点，不用提取RNA，操作简便、特异性强、灵敏度达到了3.5pg/mL，比普通PCR高100倍，且检测成本低、不需要PCR仪等分子生物学仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接观测，非常适合生菜等蔬菜病毒的检测，为LNYV的有效防治提供可靠的技术依据。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中莴苣坏死黄化病毒LNYV检测方法操作复杂、对操作人员技术水平要求高、所需仪器设备昂贵等问题，本专利技术的目的是提供一种莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP特异性检测引物组合物；本专利技术的另一目的是提供上述莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测试剂盒；本专利技术的另一目的是提供上述莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测引物组合物：由RT反向引物LNYV-R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：LNYV-R：5’-ATACCATGCCGCGAATCTGT-3’；F3：5’-ACCTAAGCCAGCAATGACAT-3’；B3：5’-TGCCCAATCCAGCCTCTT-3’；FIP：5’-CTGTTAGATACTCCCGCCTGCGACACCTCCTAACACCTCCTT-3’；BIP：5’-CTCTGGACGCAACCCGGAAGATTGCTTCGTACCTAGCCCT-3’；LF：5’-CGAGCCTAGTACCTTGATCTGAAG-3’；LB：5’-AATTTGTTGACTGAGACTGATGAGG-3’。所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物在检测莴苣坏死黄化病毒中的应用。一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP试剂盒，包括LNYV抗体IgG、RT反向引物LNYV-R、LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，其中特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，上述特异性RT反向引物LNYV-R以及LAMP引物组的序列如下：LNYV-R：5’-ATACCATGCCGCGAATCTGT-3’；F3：5’-ACCTAAGCCAGCAATGACAT-3’；B3：5’-TGCCCAATCCAGCCTCTT-3’；FIP：5’-CTGTTAGATACTCCCGCCTGCGACACCTCCTAACACCTCCTT-3’；BIP：5’-CTCTGGACGCAACCCGGAAGATTGCTTCGTACCTAGCCCT-3’；LF：5’-CGAGCCTAGTACCTTGATCTGAAG-3’；LB：5’-AATTTGTTGACTGAGACTGATGAGG-3’。除此之外，所述第一链cDNA合成试剂由10mMdNTPs、5×M-MLV反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC‑RT‑LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：①免疫捕获IC：1）取100mg感染LNYV的生菜组织，加1mL PBS研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000 rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；2）用0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液将LNYV抗体IgG稀释后混合，使LNYV抗体IgG的终浓度为10μg/mL；取100μL上述稀释的LNYV多克隆抗体 IgG加入0.2mL PCR管中，37℃孵育2h；3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3 min; 加入100μL上述感病组织粗提液，37℃孵育2h；4）弃去感病组织粗提液，用 PBST洗3次，ddH2O洗1次，短暂离心，吸去残液；②RT反应：1) 在上述免疫捕获PCR管中加入浓度为10 μM的LNYV特异性反向引物LNYV‑R 1μL，DEPC‑H2O 4μL，混合后于70℃保温10 min，之后迅速冰浴2 min；2）向上述PCR管中加入5×M‑MLV buffer 2μL、10mM dNTPs 1μL、30U/μL RNase抑制剂0.34μL、200U /μL M‑MLV反转录酶0.35μL、DEPC‑H2O 补足至10μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到cDNA第一链用于后续LAMP扩增；③LAMP扩增反应：取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行LAMP扩增，反应体系为12.5μL，包括50ng cDNA 0.5 μL、10×Thermpopol buffer 1.25μL、100mM MgSO4 0.75μL、10mM dNTPs 1.75μL、 10 μM B3 和 F3 Primer 各0.25μL、10 μM FIP 和 BIP Primer 各2.0μL、10 μM LF和 LB Primer各0.5μL、8U/μL Bst DNA polymerase 0.5μL、ddH2O 2.25μL；并以ddH2O作为阴性对照，以生菜LNYV蛋白N基因标准品作为阳性对照；LAMP的反应条件为: 58‑70℃扩增60‑100 min, 随后80℃变性10 min，终止反应；④分析判断反应产物：1）上述步骤③中LAMP反应结束后，在PCR管内侧加 1μL 1000× SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管，上下颠倒混匀，采用肉眼直接观察PCR管内混合液的颜色变化：若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有莴苣坏死黄化病毒LNYV；若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含莴苣坏死黄化病毒LNYV；2）结果的观察也可以采用琼脂糖凝胶电泳检测技术：取5μL LAMP反应产物进行2.0% 琼脂糖凝胶电泳，在1×TAE缓冲液环境中，100V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果：若凝胶中存在明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有莴苣坏死黄化病毒LNYV；若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含莴苣坏死黄化病毒LNYV。...

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒LNYV的IC-RT-LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：①免疫捕获IC：1）取100mg感染LNYV的生菜组织，加1mLPBS研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；2）用0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液将LNYV抗体IgG稀释后混合，使LNYV抗体IgG的终浓度为10μg/mL；取100μL上述稀释的LNYV多克隆抗体IgG加入0.2mLPCR管中，37℃孵育2h；3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3min;加入100μL上述感病组织粗提液，37℃孵育2h；4）弃去感病组织粗提液，用PBST洗3次，ddH2O洗1次，短暂离心，吸去残液；②RT反应：1)在上述免疫捕获PCR管中加入浓度为10μM的LNYV特异性反向引物LNYV-R1μL，DEPC-H2O4μL，混合后于70℃保温10min，之后迅速冰浴2min；2）向上述PCR管中加入5×M-MLVbuffer2μL、10mMdNTPs1μL、30U/μLRNase抑制剂0.34μL、200U/μLM-MLV反转录酶0.35μL、DEPC-H2O补足至10μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15min，得到cDNA第一链用于后续LAMP扩增；③LAMP扩增反应：取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行LAMP扩增，反应体系为12.5μL，包括50ngcDNA0.5μL、10×Thermpopolbuffer1....

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉宝，王亚军，谢忠奎，郭志鸿，何玉惠，邱阳，
申请(专利权)人：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62