一种臭椿多糖的制备方法及其在防治烟草病毒上的应用，其特征在于：所述臭椿多糖是以臭椿的茎皮为原料经水提醇沉制备而成。将本发明专利技术制得的臭椿多糖配制成水剂，施加到心叶烟上可以防治烟草花叶病毒。本发明专利技术的有益效果是，提供的一种具有防治烟草病毒作用的臭椿多糖的制备方法，以臭椿茎皮作为原料，原材料来源广泛，原料成本低；以水为提取试剂，无污染；提取过程简单、设备要求低、提取过程成本低；所制备的提取物对TMV具有体外抑制作用和侵染位点的抑制作用；提取物来源于植物，对人畜和环境安全性高，属于一种天然、绿色无污染的植物源抗病毒制剂。
【技术实现步骤摘要】
一种臭椿多糖制备方法及其在防治烟草病毒上的应用
本专利技术属于烟草病害防治
，涉及植物提取物的制备方法，具体是一种臭 椿多糖的提取制备方法，以及对烟草病毒的防治作用。
技术介绍
病毒病是烟草上发生最普遍、危害最严重的病害。2006年我国烟草病毒病发生面 积240. 63万亩，造成产量损失2810. 72万公斤，产值损失25161. 85万元，占病虫害总损失 的37.7%。烟草花叶病毒（TbAacco mosaic η>?·5，ΤΜν)在烟草上发生最普遍，我国各烟区 均有发生，田间发病率一般在59Γ20%。病毒的侵染造成烟草生理功能紊乱，化学成分失调， 不但使烟叶产量严重下降，而且使烟叶的品质严重变劣，病毒病的发生越来越成为我国优 质烟叶生产的一大障碍。由于病毒的绝对寄生性，病毒复制所需要的物质、能量、场所等完 全由寄主提供，加上植物没有动物那样完整的免疫代谢系统，这就给高选择性的化学抗病 毒制剂开发与植物病毒病的防治带来很大的困难，目前仍没有有效控制病毒病的药剂。 臭椿(Mill.) Swingle)为枯木科臭椿属植物，我国大 部分地区都有分布。臭椿根皮、茎皮和果实均为我国传统中药，具有除热，燥湿，涩肠，止 血，杀虫、消炎等功效。在农业生广中，臭棒可以制备成为杀虫剂(贺春贵等.几种植物杀 虫剂的初步研究，甘肃农业大学学报，1996,（3) :233~235;植物素杀虫剂，专利申请号： 01128624.5)。研究发现，臭椿也具有防治植物病毒的作用，目前已有臭椿提取物制备抗病 毒剂的研究和专利(沈建国等.臭椿抗烟草花叶病毒活性物质的提取及初步研究.中国 生物防治.2007 (4);臭椿抗植物病毒剂及其制备方法，专利申请号：200510044113. 2)。 200510044113. 2公布的臭椿抗植物病毒剂使用氯仿、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂作为提取 齐U，并提供了其制备方法。 植物多糖（Polysaccharide)又称植物多聚糖，是由十个以上单糖通过糖苷键聚 合而成的一种天然生物大分子，其相对分子质量可达数万甚至数百万。研究发现植物多 糖具有不同的生物学活性。已经证明植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等 多种生物活性，而且具有毒副作用小和无残留等优点（Tao YW.Tian GY. Studies on the physicochemical properties, structure and antitumor activity of polysaccharide YhPS-1 from the root of Cor dal is yanhusuo Wang [J]. Chinese Journal of Chemistry, 2006,24(2):235-239. Ge Y. Duan YF, Fang GZ, et al. Study on biological activities of Physalis alkekengi var francheti polysaccharide[J]. J Sci Food Agric，2009，89(9): 1593-1598.)。在植物病毒防治研究领域，关于多糖防 治植物病毒的研究报道很少。研究发现，毛头鬼伞真菌多糖具有抗烟 草花叶病毒的活性，分离纯化得到的多糖组分CCP60a可以使TMV外壳蛋白的表达明显降低 (吴艳兵，谢荔岩，谢联辉等.毛头鬼伞多糖CCP60a对TMV外壳蛋白的影响.植物资源 与环境学报，2008, 17(3) :63-66.)。 植物多糖提取的经典方法是水提醇沉法(张智芳，林文庭，陈灿坤.植物多糖提 取工艺的研究进展[J].海峡预防医学杂志，2008, 14(3) :18-20.)，也就是采用热水浸提， 再利用多糖不溶于有机溶剂的性质使用乙醇将多糖从提取液中沉淀出来。另外，由于植物 组织中也含有大量的蛋白质，在多糖提取过程中，必须去除蛋白质。具体原理是利用蛋白质 遇有机溶剂变性沉淀的特点，利用三氯乙酸或者Sevag试剂使多糖溶液中的蛋白质沉淀去 除。迄今，已经有植物多糖提取方法的专利，如灵芝孢子多糖、制备方法和应用（专利申请 号：CN201410020206. 0)，一种黄参多糖制备方法(专利申请号：CN200710307283. 4)等，但 还没有臭椿多糖制备方法以及防治植物病毒的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有防治烟草病毒作用的臭椿多糖的制备方法，本 方法以臭椿为原料，以水作为提取剂，经过热水浸提，去除蛋白，乙醇沉淀，去除杂质等步骤 制备得到臭椿多糖，经试验证明，臭椿多糖对TMV具有明显的体外抑制作用和侵染位点的 抑制作用。 本专利技术的目的通过以下技术方案来实现： 一种臭椿多糖的制备方法，以臭椿的茎皮为原料经水提醇沉制备而成，具体步骤依次 如下： 1) 经过前处理的臭椿茎皮，置于20?60°C条件下烘干，之后将其粉碎至40目； 2) 取步骤1所制备的臭椿粉，按照水：粉(体积/质量）=10?30 :1，在50?90°C条件 下提取1?4 h，间歇搅拌。过滤，收集滤液，重复提取过程1次，合并2次滤液，将滤液减压 浓缩至原体积的1/5?1/10 ; 3) 加入0. 2倍体积的Sevag试剂（氯仿：正丁醇=4 :1)，剧烈振摇20min，静置20min， 5000rpm离心lOmin，小心收集水相，去除蛋白层。重复该步骤多次，直至无蛋白沉淀析出。 4)水相用蒸馏水透析36h，去除小分子有机物和无机盐。加入浓缩液2?5倍的 乙醇，在_20°C?10°C条件下沉淀12?48h，使多糖沉淀并析出。5000rpm离心收集沉淀。 5)沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，进行脱水并去除一些有机物污 染。30?70°C干燥，研磨成粉备用。 在本专利技术中，步骤1)中所述的前处理是指洗涤、晾晒过程。步骤2)中的最佳提取 温度为90°C，此温度下提取率最高。 将本专利技术制得的臭椿多糖用水配制成0. 25%?0. 75%的浓度，施加到心叶烟上可 以防治烟草花叶病毒的侵染。其具体防治方法及计算方式如下： 1.体外抑制作用 选择健康、生长旺盛的6?8叶期心叶烟，右半叶摩擦接种多糖溶液与病毒等体积混 合液(病毒终浓度为5 μ g/mL)，左半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液作对照，每株接种 4?5个叶片，每处理接种3株，3 d后统计枯斑数目，以下列公式计算抑制率。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种臭椿多糖的制备方法，其特征在于：以臭椿的茎皮为原料经水提醇沉制备而成，具体步骤依次如下：1）经过前处理的臭椿茎皮，置于20～60℃条件下烘干，之后将其粉碎至40目；2）取步骤1所制备的臭椿粉，按照水：粉（体积/质量）=10～30：1，在50～90℃条件下提取1～4 h，间歇搅拌，过滤，收集滤液，重复提取过程1次，合并2次滤液，将滤液减压浓缩至原体积的1/5～1/10；3）加入0.2倍体积的Sevag试剂，剧烈振摇20min，静置20min，5000rpm离心l0min，小心收集水相，去除蛋白层；重复多次，直至无蛋白沉淀析出；4）水相用蒸馏水透析36h，加入浓缩液2～5倍的乙醇，在‑20℃～10℃条件下沉淀12～48h；5000rpm离心收集沉淀；5）沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤两次，去除杂质，30～70℃干燥，研磨成粉备用。
【技术特征摘要】
1. 一种臭椿多糖的制备方法，其特征在于：以臭椿的茎皮为原料经水提醇沉制备而 成，具体步骤依次如下： 1) 经过前处理的臭椿茎皮，置于20?60°C条件下烘干，之后将其粉碎至40目； 2) 取步骤1所制备的臭椿粉，按照水：粉(体积/质量）=10?30 :1，在50?90°C条件 下提取1?4 h，间歇搅拌，过滤，收集滤液，重复提取过程1次，合并2次滤液，将滤液减压 浓缩至原体积的1/5?1/10 ; 3) 加入0. 2倍体积的Sevag试剂，剧烈振摇20min，静置20min，5000rpm离心lOmin，小 心收集水相，去除蛋白层； 重复多次，直至无蛋白沉淀析出； 4) 水相...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗朝鹏，王燃，李锋，杨军，魏春阳，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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