本发明专利技术提供了一种具有高逆转录效率的耐高温逆转录酶突变体及其应用，具体地，本发明专利技术构建了逆转录酶(M-MLV)突变库，通过逐步筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的突变体(逆转录酶突变体Mu_40)。在高温条件下(58℃)，与野生型相比，本发明专利技术的逆转录酶突变体Mu_40的逆转录效率提高了46.52倍。体Mu_40的逆转录效率提高了46.52倍。
【技术实现步骤摘要】
一种具有高逆转录效率的耐高温逆转录酶突变体及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种具有高逆转录效率的耐高温逆转录酶突变体及其应用。
技术介绍
[0002]鼠白血病逆转录酶(M-MLV)是一种以RNA为模板的DNA聚合酶，具有RNase H活性，不具有3
’-5’
外切酶活性，可用于逆转录合成cDNA。由于RNA具有较复杂的二级结构，对M-MLV酶的逆转录效率影响较大。打开RNA二级结构最简单的方法是通过高温使二级结构的氢键打开，RNA变为线性单链。但野生型的M-MLV酶最适反应温度为37℃，高温下稳定性下降并且活性降低。因此通过突变使M-MLV酶的热稳定性提高，使其适应高温下的反应是M-MLV酶的主要改造方向。
[0003]M-MLV酶的突变改造有以下的途径：
[0004]1、随机突变。对M-MLV全长序列或者某一结构域进行随机突变，然后进行筛选。此方法可筛选出高活性和高热稳定性的MMLV突变体，但技术过程繁复，随机突变产生的突变库容量可达到107，伴随大量的无活性突变，筛选难度极大。(参考文献：Arezi B,Hogrefe H.Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer[J].Nucleic Acids Research,2008,37(2):473-481.)
[0005]2、对特定活性位点进行定点突变。此方法针对性较强，通过增加核酸结合位点、金属离子结合位点等关键活性位点氨基酸与底物的亲和力，提高酶活。但此方法缺乏对酶整体结构的分析，不能从整体上提高酶的稳定性。(参考文献：Yasukawa K,Mizuno M,Konishi A,et al.Increase in thermal stability of Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase by site-directed mutagenesis[J].Journal of Biotechnology,2010,150(3):299-306.)
[0006]总体而言，由于蛋白质结构的复杂性，不仅是位于活性位点的氨基酸甚至一些远离活性位点的氨基酸都可能对酶的整体结构及性能产生影响，因此酶的改造存在极大的不确定性。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的在于提供一种耐高温且具有高逆转录效率的逆转录酶突变体。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种逆转录酶突变体，所述逆转录酶突变体在对应于野生型鼠白血病逆转录酶(M-MLV)的氨基酸序列的第221位的氨基酸残基位点发生突变，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
[0009]在另一优选例中，所述逆转录酶突变体中，第221位的氨基酸残基位点突变为Arg。
[0010]在另一优选例中，所述逆转录酶突变体的氨基选序列与SEQ ID NO.3相比具有至少约80％的同源性；更优选地，具有至少约90％的同源性；最优选地，具有至少约95％的同
源性；如具有至少约96％、97％、98％、99％的同源性。
[0011]在另一优选例中，所述逆转录酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
[0012]本专利技术的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码本专利技术第一方面所述的逆转录酶突变体。
[0013]本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第二方面所述的核酸分子。
[0014]本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第一方面所述的载体或染色体整合有本专利技术第二方面所述的核酸分子。
[0015]在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞、或真核细胞。
[0016]在另一优选例中，所述原核细胞为大肠杆菌。
[0017]在另一优选例中，所述真核细胞为酵母细胞。
[0018]本专利技术的第五方面，提供了一种制备本专利技术第一方面所述的逆转录酶突变体的方法，包括步骤：
[0019](i)在适合的条件下，培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的逆转录酶突变体；和
[0020](ii)分离所述的逆转录酶突变体。
[0021]在另一优选例中，所述步骤(i)中培养所述宿主细胞的温度为20℃-40℃；优选为25℃-37℃，如35℃。
[0022]本专利技术的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术第一方面所述的逆转录酶突变体。
[0023]在另一优选例中，所述试剂盒还包含选自下组的一种或多种组分：
[0024]dNTP、缓冲液、随机引物、和纯水。
[0025]本专利技术的第七方面，提供了本专利技术第一方面所述的逆转录酶突变体在制备逆转录检测试剂或逆转录试剂盒中的用途。
[0026]本专利技术的第八方面，提供了一种RNA逆转录方法，所述方法包括步骤：
[0027](1)提供含有RNA的样品；
[0028](2)逆转录反应
[0029]使用本专利技术第一方面所述的逆转录酶突变体对步骤(1)提供的含有RNA的样品进行逆转录。
[0030]在另一优选例中，所述步骤(2)中，逆转录反应温度为55℃以上，优选地为58℃以上。
[0031]应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
[0032]本专利技术人通过广泛而深入的研究，构建了逆转录酶(M-MLV)突变库，通过逐步筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的突变体。在此基础上，完成了本专利技术。
[0033]在描述本专利技术之前，应当理解本专利技术不限于所述的具体方法和实验条件，因为这
类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本专利技术的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0034]除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0035]虽然在本专利技术的实施或测试中可以使用与本专利技术中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0036]逆转录酶
[0037]逆转录酶(reverse transcriptase,成转录酶)又称为依赖RNA的DNA聚合酶。该酶以RNA为模板，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种逆转录酶突变体，其特征在于，所述逆转录酶突变体在对应于野生型鼠白血病逆转录酶(M-MLV)的氨基酸序列的第221位的氨基酸残基位点发生突变，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。2.如权利要求1所述的逆转录酶突变体，其特征在于，所述逆转录酶突变体中，第221位的氨基酸残基位点突变为Arg。3.如权利要求1所述的逆转录酶突变体，其特征在于，所述逆转录酶突变体的氨基选序列与SEQ ID NO.3相比具有至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。4.如权利要求1所述的逆转录酶突变体，其特征在于，所述逆转录酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，刘霭珊，赵继光，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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