一种特异性检测当归ToMV病毒的IC-RT-LAMP检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性检测当归ToMV病毒的IC‑RT‑LAMP检测方法，其步骤主要包括用ToMV的抗体IgG特异性捕获ToMV病毒粒子，利用ToMV的特异性引物进行反转录RT反应合成cDNA，再利用特异性的LAMP引物组进行LAMP扩增，反应结束后利用荧光染料肉眼观察法或琼脂糖凝胶电泳检测待检样品是否含有ToMV病毒。本发明专利技术特异性强，灵敏度达到了0.45 pg/mL，比普通PCR高100倍，且无需提取RNA，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率、为当归ToMV的检测提供了新的技术平台，可用于监控当归ToMV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

A specific IC-RT-LAMP method for detection of ToMV virus in Angelica sinensis

The invention discloses a specific detection method for IC ToMV RT LAMP of Angelica sinensis virus. The steps include the specific capture of ToMV virus particles by using antibody IgG of ToMV, the use of ToMV specific primers for the synthesis of cDNA by reverse transcription RT reaction, and the use of specific LAMP inducing group for the expansion of the female. Swimming tests were conducted to determine whether the samples tested contained ToMV virus. The invention has strong specificity, high sensitivity of 0.45 pg/mL, 100 times higher than ordinary PCR, no need to extract RNA and professional equipment, simplifies the operation process, reduces the detection difficulty, improves the detection efficiency, provides a new technical platform for the detection of Angelica ToMV, can be used to monitor the occurrence, spread and prevalence of Angelica ToMV virus, and is suitable for popularization and application at the grass-roots level. \u3002

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测当归ToMV病毒的IC-RT-LAMP检测方法
本专利技术涉及一种特异性检测侵染当归的番茄花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。
技术介绍
当归（Angelicasinensis），别名岷当归、干归、马尾当归、马尾归、云归、西当归、金当归、土当归，属伞形科多年生草本植物，常以根入药，具补血、活血、止痛、润肠之功效；含基本内酯(ligusiilide)、正丁烯酞内酯(n-butylidenephthalide)、阿魏酸、维生素B12、维生素E、烟酸、蔗糖和多种氨基酸，以及倍半萜类化合物等。由于成份独特，其药用价值很高，有“十方九归”之说，除补血、活血、调经止痛、润燥通便外，还有镇静大脑、护肤、减少色素沉积、抗辐射和调节非特异性免疫功能的作用，对冠心病、脉管炎、脑血管病及白细胞减少有显著疗效，对肿瘤疾病有较好的防治作用。当归在国内多省均有分布，如云南、贵州、四川、甘肃和青海等地，特别是甘肃省岷县当归种植历史悠久，品质极佳，产量第一，素有“中国当归之乡”和“千里药乡”之称，其当归又称“岷归”，远销东南亚、港澳台以及欧美等20多个国家和地区，国内、外销售量分别占全国总产量的70%和90%以上。目前国家已在甘肃岷县建立了优质当归生产基地，当归种植已成为当地的支柱产业，种植面积逐年扩大。随着人工种植规模和地域的不断扩大，病害对当归生产的影响日益突出。如麻口病、根腐病，其主要致病原因为真菌和线虫。病毒病也时有发生，主要危害叶片，发病初期，仅上部叶片现轻微花叶，后逐渐出现不规则的黄绿疱斑花叶，且叶片略变硬变脆，部分叶片叶缘呈不规则锯齿状，有少数叶片变细呈蕨叶状，部分叶片正常，但叶面产生疱状，叶面稍现畸形。目前已报到的侵染中草药当归的病毒种类主要有番茄花叶病毒（Tomatomosaicvirus，ToMV）。ToMV是烟草花叶病毒属Tobamovirus的成员之一，其寄主范围很广，能侵染茄科、十字花科、禾本科、藜科、豆科等多种植物，中草药当归也是其主要的寄主。ToMV粒子为短杆状，基因组为单链正义RNA，大小约为6.4kb，编码了3个非结构蛋白和17.6kDa的外壳蛋白（CoatProtein，CP）。通过汁液机械摩擦、种子带毒和蚜虫传播。当前防治当归病毒病首先依靠准确的病毒检测、病株移除以及无毒种苗生产等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此ToMV的检测对于当归病毒病的防治具有重要的意义。目前，针对ToMV的检测方法主要有指示植物法、电镜技术、酶联免疫吸附法（ELISA）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等，但这些方法和技术都存在一些缺陷。指示植物法检测速度慢，且受季节限制，多数情况下还需要结合电镜观察病原形态和血清学试验才能做出判定。电镜技术能直接观察病毒生物大分子的亚基单位，适用于一些未知病毒，以及难以提纯的病毒材料的观察检测等，但由于病毒颗粒易于降解常常影响正确诊断，并且电镜设备昂贵，难以普及，故其应用大大受到限制，一般只能用于研究。ELISA法的灵敏度不够高，易出现非特异性反应，还必须依赖酶标仪等专业设备。RT-PCR方法检测特异性强、灵敏度高，但与本专利技术相比，需要提取高质量的RNA，操作复杂，所需试剂昂贵，对检测人员的技术水平要求高，除此之外，还必须依赖PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备，推广普及应用受到很大限制。DNA环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上多个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BstDNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。与常规检测的PCR方法相比，LAMP技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。本专利技术将免疫捕获IC与LAMP技术有机结合，成功建立了IC-RT-LAMP技术特异检测侵染当归的番茄花叶病毒的方法。IC-RT-LAMP结合了血清学和LAMP两种方法的优点，不用提取RNA，操作简便、特异性强、灵敏度达到了0.45pg/mL，比普通PCR高100倍、且检测成本低、不需要PCR仪等分子生物学仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接观测，非常适合当归等中药材的病毒检测，为ToMV的高效防治提供技术支撑。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中番茄花叶病毒ToMV检测方法操作复杂、对操作人员技术水平要求高、所需仪器设备昂贵的问题，本专利技术的目的是提供一种侵染当归的番茄花叶病毒ToMV的IC-RT-LAMP特异性检测引物组合物；本专利技术的另一目的是提供上述番茄花叶病毒ToMV的IC-RT-LAMP检测试剂盒；本专利技术的另一目的是提供上述番茄花叶病毒ToMV的IC-RT-LAMP检测方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于特异性检测侵染当归的番茄花叶病毒IC-RT-LAMP检测引物组合物：由RT反向引物ToMV-R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成；各引物序列具体如下：ToMV-R：5’-GATGCAGGTGCAGAGGTCCAG-3’；F3：5’-TTTTAGATCCTCTAATTACTGCG-3’；B3：5’-CCAACCCAGACATACTTTCA-3’；FIP：5’-GTCGGACTCTGCTGGTTTTTTATTGCTGGGGACTTTCGATA-3’；BIP：5’-GGTAGACGACGCTACGGTTGTCCAGTACCTCTTACTAGTTCAT-3’。所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物在检测番茄花叶病毒中的应用。一种特异性检测侵染当归的番茄花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒，包括ToMV抗体IgG、RT反向引物ToMV-R、LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，其中特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、上述特异性RT反向引物JHMV-R以及LAMP引物组的序列如下：ToMV-R：5’-GATGCAGGTGCAGAGGTCCAG-3’；F3：5’-TTTTAGATCCTCTAATTACTGCG-3’；B3：5’-CCAACCCAGACATACTTTCA-3’；FIP：5’-GTCGGACTCTGCTGGTTTTTTATTGCTGGGGACTTTCGATA-3’；BIP：5’-GGTAGACGACGCTACGGTTGTCCAGTACCTCTTACTAGTTCAT-3’。除此之外，所述第一链cDNA合成试剂由10mMdNTPs、5×M-MLV反应缓冲液、30U/μLRNase抑制剂、200U/μLM-MLV反转录酶和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性检测当归ToMV病毒的IC‑RT‑LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：①免疫捕获IC：1）取100mg感染ToMV的当归组织，加1mL PBS研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000 rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；2）用0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液将ToMV抗体IgG稀释后混合，使ToMV抗体IgG的终浓度为10μg/mL；取100μL上述稀释的ToMV多克隆抗体 IgG加入0.2mL PCR管中，37℃孵育2h；3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3 min; 加入100μL上述感病组织粗提液，37℃孵育2h；4）弃去感病组织粗提液，用 PBST洗3次，ddH2O洗1次，短暂离心，吸去残液；②RT反应：1) 在上述免疫捕获PCR管中加入浓度为10 μM的ToMV特异性反向引物ToMV‑R 1μL，DEPC‑H2O 4μL，混合后于70℃保温10 min，之后迅速冰浴2 min；2）向上述PCR管中加入5×M‑MLV buffer 2μL、10mM dNTPs 1μL、30U/μL RNase抑制剂0.34μL、200U /μL M‑MLV反转录酶0.35μL、DEPC‑H2O 补足至10μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到cDNA第一链用于后续LAMP扩增；③LAMP扩增反应：取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行LAMP扩增，反应体系为12.5μL，包括50ng cDNA 0.5 μL、10×Thermpopol buffer 1.25μL、100mM MgSO4 0.75μL、10mM dNTPs 1.75μL、 10 μM B3 和 F3 Primer 各0.25μL、 10 μM FIP 和 BIP Primer 各2.0μL、8U/μL Bst DNA polymerase 0.5μL、ddH2O 3.25μL；并以ddH2O作为阴性对照，以当归ToMV CP基因标准品作为阳性对照；LAMP的反应条件为: 60‑70℃扩增60‑100 min, 随后80℃变性10 min，终止反应；④分析判断反应产物：1）上述步骤③中LAMP反应结束后，在PCR管内侧加 1μL 1000× SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管，上下颠倒混匀，采用肉眼直接观察PCR管内混合液的颜色变化：若混合液颜色变为绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有ToMV；若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含ToMV；2）结果的观察也可以采用琼脂糖凝胶电泳检测技术：取5μL LAMP反应产物进行2.0% 琼脂糖凝胶电泳，在1×TAE缓冲液环境中，100V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果：若凝胶中存在明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有ToMV；若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含ToMV。...

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测当归ToMV病毒的IC-RT-LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：①免疫捕获IC：1）取100mg感染ToMV的当归组织，加1mLPBS研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；2）用0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液将ToMV抗体IgG稀释后混合，使ToMV抗体IgG的终浓度为10μg/mL；取100μL上述稀释的ToMV多克隆抗体IgG加入0.2mLPCR管中，37℃孵育2h；3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3min;加入100μL上述感病组织粗提液，37℃孵育2h；4）弃去感病组织粗提液，用PBST洗3次，ddH2O洗1次，短暂离心，吸去残液；②RT反应：1)在上述免疫捕获PCR管中加入浓度为10μM的ToMV特异性反向引物ToMV-R1μL，DEPC-H2O4μL，混合后于70℃保温10min，之后迅速冰浴2min；2）向上述PCR管中加入5×M-MLVbuffer2μL、10mMdNTPs1μL、30U/μLRNase抑制剂0.34μL、200U/μLM-MLV反转录酶0.35μL、DEPC-H2O补足至10μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15min，得到cDNA第一链用于后续LAMP扩增；③LAMP扩增反应：取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行LAMP扩增，反应体系为12.5μL，包括50ngcDNA0.5μL、10×Thermpopol...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉宝，王若愚，谢忠奎，王筠，赵霞，周琴，
申请(专利权)人：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62