【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品检测，涉及蜂蜜的品质与来源检测，具体涉及用于蜂蜜来源检测的dna探针与蜂蜜检测方法。
技术介绍
1、蜂蜜市场存在的造假行为严重影响了市场秩序，阻碍了蜂蜜市场的长期发展。目前常见的造假行为包括将一定比例的植物糖浆如麦芽糖将、玉米糖浆、大米糖浆等混入蜂蜜原浆中，或将低价的蜂蜜掺入高价蜂蜜中。
2、国内外学者针对蜂蜜掺假问题开展了大量的研究工作，并提出多种鉴别方法，包括从物理性质、化学成分、同位素比率法、遗传技术等多方面入手。
3、蜂蜜中的花粉可以反映蜂蜜的来源、种类，因此花粉分析可以成功地鉴定蜂蜜的花源，从而确定蜂蜜的品质。针对蜂蜜中残留花粉的分析手段，包括感官分析与理化分析，但是感官分析法过于依赖人工经验，且无法准确在实践中鉴别蜂蜜的具体构成。理化分析法可以通过实验测定蜂蜜中水、可溶性固形物、有机酸、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖等物质的含量，从而判断蜂蜜的类别。然而市场上蜂蜜的种类繁多、成分复杂、组分变化大，常规理化分析方法的实验成本较高、条件严格，消耗时间过长。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提出了用于蜂蜜来源检测的dna探针与蜂蜜检测方法，设计了用于花粉检测的dna探针，并通过蜂蜜样本与特异性引物的扩增实验结果，判断样本的花粉构成、生产时间、生产地点，实现蜂蜜来源和品质的检测。
2、用于蜂蜜来源检测的dna探针，包括产地检测引物探针序列、蜂源检测引物探针序列和生产时间检测引物探针序列。
3、所述产地
4、所述蜂源检测引物探针序列包括中蜂引物探针和意蜂引物探针。其中中蜂引物探针的上游序列为5'-attcttgcacagcatctttgcacat-3'，下游序列为5'-cttttcgatactgctttagccaat-3'。意蜂引物探针的上游序列为5'-gttagtcaaaattcaacagttcttt-3'，下游序列为5'-tggaaacacttacttagatactgca-3'。
5、所述生产时间检测引物探针序列包括五倍子引物探针与枇杷引物探针，分别用于判断蜂蜜样本的生产时间为夏季或冬季。其中五倍子引物探针的上游序列为5'-aaacctgcctagcagaacga-3'，下游序列为5'-taagatttccttggcgcaat-3'。枇杷引物探针的上游序列为5'-gcccggcgtccccttatc-3'，下游序列为5'-atcgcatttcgctacgttcttcat-3'。
6、一种蜂蜜检测方法，基于上述引物探针序列实现蜂蜜样本的产地、蜂源以及生产时间检测。其主要原理是：柃属植物在浙江南部分布广泛，花期为4至5月，因此采用柃属植物引物探针可以鉴别蜂蜜产地与生产时间。五倍子花期主要为7月至9月，枇杷花期为10月至次年1月，因此选取五倍子引物与枇杷引物可以鉴别蜜源的生产季节。根据三种植物源引物对蜂蜜样本dna的扩增结果进行横向对比来判断蜂蜜样本中的蜜源构成，并根据中蜂引物探针和意蜂引物探针来进一步判断蜂源构成。具体步骤如下：
7、步骤1、提取待检测蜂蜜样本，采用ctab法提取dna并测量浓度。若蜂蜜样本中的dna浓度高于设定阈值，进入步骤2，否则判定该待测蜂蜜为掺杂了浓缩加工蜜或糖浆的产品。
8、步骤2、设计实时荧光定量pcr反应体系，使用上述5种引物探针序列，分别对步骤1中提取的蜂蜜样本dna进行扩增。
9、步骤3、记录步骤2中实时荧光定量pcr反应结果，若未出现扩增曲线，说明步骤1提取出的蜂蜜样本dna中不含有5种引物对应的dna成分。若出现扩增曲线，说明提取的蜂蜜样本dna中含有引物对应的dna成分，ct值越低，说明对应的dna成分在蜂蜜样本中的占比越高。进一步根据ct值判断蜂蜜产地、蜂源为中蜂、意蜂或其他，以及生产季节为冬季、夏季或其他。
10、作为优选，蜂蜜样本的dna浓度设定阈值为10ng/μl。
11、作为优选，通过ctab法提取蜂蜜样本dna并测量浓度的具体步骤为：
12、s1.1、取0.5ml ctab抽提液，与2-me按照50：1体积比混匀，60℃预热。
13、s1.2、取15g蜂蜜样本到体积为50ml的离心管中，加入20ml纯水，震荡均匀或50℃水浴加热至蜂蜜溶解。以4500r/min的速度离心10min后去上清，再加入20ml纯水，以4500r/min的速度离心10min后去上清，保留沉淀物。
14、s1.3、向s1.2所得的沉淀物中加入s1.1预热后的溶液，充分混匀后，在65℃的温度下温育60min，温育过程中混匀。向温育后的溶液加入0.5ml氯仿，颠倒混匀后以8000g的离心力离心8min后，收集上清液。
15、s1.4、将s1.3所得的上清液转移至新的离心管中，加入1/2～2/3离心管体积的预冷的dna沉淀液，混匀后在室温下静置，直到在管底观察到沉淀后，以2000g的离心力离心2min，轻弃上清液，得到松散的dna沉淀物。
16、s1.5、将s1.4得到的松散的dna沉淀物转移到1.5ml离心管中，加入1ml的dna洗涤液，在室温下静置20min，然后以4000g的离心力离心10min，轻弃上清液，得到dna沉淀物。
17、s1.6、对s1.5得到的dna沉淀物进行自然干燥，然后加入体积为15μl的tebuffer，利用微量分光光度计，检测从蜂蜜样本中提取的dna浓度。
18、作为优选，所述实时荧光定量pcr反应体系的总体积为10μl，其中taq dna聚合酶5μl，上、下游引物各0.5μl，ddh2o 3μl，dna 1μl。
19、作为优选，对蜂蜜样本dna进行扩增的程序为：
20、s2.1、在95℃下预变性2min。
21、s2.2、在95℃下反应5s，在55℃下反应30s，在72℃下反应30s，同时收集荧光信号。在95℃下反应10s，重复39次后进入s3.3。
22、s2.3、根据s2.2中收集的荧光信号绘制荧光扩增曲线，统计ct值。
23、作为优选，对于ct值小于37的，将结果视为阳性，表示提取的蜂蜜样本dna中含有引物对应的dna成分。
24、本专利技术具有以下有益效果：
25、1、以蜂蜜中dna构成的差异性为切入点，通过ctab粗提法提取蜂蜜样本当中dna成分，通过微量分光光度计测量得到的dna含量来初步判断目的样本是否掺假，进一步通过荧光定量pcr法进行蜂蜜鉴定，对比其扩增结果，以判断不同蜂蜜样本的花粉构成、生产时间、生产地点，依此对蜂蜜进行谱系分类。
26、2、检测过程的成本低廉且操作简单，能够一次性检测大量样本，且对检测目标蜂蜜样本消耗少，检测全过程不需要使用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于蜂蜜来源检测的DNA探针，其特征在于：包括产地检测引物探针序列、蜂源检测引物探针序列和生产时间检测引物探针序列；
2.如权利要求1所述用于蜂蜜来源检测的DNA探针，其特征在于：所述柃属植物引物探针的上游序列为5'-AATCTCGAGGCTTGTGCAGT-3'，下游序列为5’-TGTTAGGCCCTGCTATTTGG-3’；
3.一种蜂蜜检测方法，其特征在于：基于权利要求1或2任一所述的DNA探针，实现蜂蜜样本的产地、蜂源以及生产时间检测，具体步骤如下：
4.如权利要求3所述一种蜂蜜检测方法，其特征在于：蜂蜜样本的DNA浓度设定阈值为10ng/μl。
5.如权利要求3所述一种蜂蜜检测方法，其特征在于：通过CTAB法提取蜂蜜样本DNA并测量浓度的具体步骤为：
6.如权利要求3所述一种蜂蜜检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应体系的总体积为10μl，其中Taq DNA聚合酶5μl，上、下游引物各0.5μl，ddH2O 3μl，DNA 1μl。
7.如权利要求3所述一种蜂蜜检测方法，其特征在于：对
8.如权利要求3所述一种蜂蜜检测方法，其特征在于：对于Ct值小于37的，将结果视为阳性，表示提取的蜂蜜样本DNA中含有引物对应的DNA成分。
...【技术特征摘要】
1.用于蜂蜜来源检测的dna探针，其特征在于：包括产地检测引物探针序列、蜂源检测引物探针序列和生产时间检测引物探针序列；
2.如权利要求1所述用于蜂蜜来源检测的dna探针，其特征在于：所述柃属植物引物探针的上游序列为5'-aatctcgaggcttgtgcagt-3'，下游序列为5’-tgttaggccctgctatttgg-3’；
3.一种蜂蜜检测方法，其特征在于：基于权利要求1或2任一所述的dna探针，实现蜂蜜样本的产地、蜂源以及生产时间检测，具体步骤如下：
4.如权利要求3所述一种蜂蜜检测方法，其特征在于：蜂蜜样本的dna浓度设定阈值为10n...
【专利技术属性】
技术研发人员：王笑语，沈伟，岳万福，吴攀，王承丽，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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