【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境科学领域，涉及一种高效水解聚酯型聚氨酯塑料的真菌角质酶及其应用。
技术介绍
1、聚氨酯(polyurethane，pu)塑料是一类聚合物，广泛应用于医疗、汽车和工业领域。pu占所生产塑料的近8％，这使它们成为世界上第六大聚合物，目前根据统计，我国在2020年pu消费量为1175万吨，预计2025年消费量将达到1828万吨。大量使用pu塑料的同时，必定会产生pu废弃物。pu塑料的持续使用、积累以及对土壤和水的污染对环境造成非常严重的威胁，pu塑料在自然环境中降解产物主要为醇、酸和胺类小分子产物，具有比其他塑料水解产物毒性更大的二胺类化合物，如2,4-二氨基甲苯(2,4-tda)或2,6-二氨基甲苯(2,6-tda)和4,4-二氨基二苯甲烷(4,4-mda)。因此，加强pu等塑料废弃物的有效处置，已经成为全人类急需面对的重大现实问题。
2、pu塑料的酶法解聚是以绿色方式解决这些废塑料造成的环境问题，在合适温度下反应，没有化学催化剂参与，这种温和过程比化学过程更加绿色环保。此外，酶法解聚pu生成的单体可以用于升级合成新的大分子，一个典型的例子是聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)的回收，法国carbios公司利用植物堆肥来源的角质酶lcc在16h内可分解97％的pet塑料，将分解所得产物重新反应生成新塑料，这种方法被认为是一种有前途的生物技术回收方法。但目前已发现的pu降解酶种类非常少。来源于pseudomonas fluorescens的酯酶pula、来源于comamonas acidovorans tb-3
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高效水解聚酯型聚氨酯塑料的真菌角质酶及其应用。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术公开了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术公开了一种角质酶编码基因cpcut1。
4、所述角质酶编码基因cpcut1的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seqid no.2所示。
5、第二方面，本专利技术公开了上述第一方面所述角质酶编码基因cpcut1编码的角质酶cpcut1。
6、第三方面，本专利技术公开了一种产角质酶cpcut1的基因工程菌。
7、所述基因工程菌以pmco-aoxα质粒为载体，以毕赤酵母为宿主，通过克隆角质酶编码基因cpcut1得到。
8、第四方面，本专利技术公开了上述第三方面所述基因工程菌在产角质酶cpcut1中的应用。
9、其中，将基因工程菌的种子液以4％～8％v/v接种到含有博来霉素抗性的ypd液体培养基中进行第一培养得到第一菌液，所得第一菌液以0.5％～2％v/v接种到bmgy液体培养基中培养得到第二菌液，所得第二菌液离心得到菌体，所得菌体重悬于bmmy液体培养基中培养，加入乙醇发酵，得到角质酶cpcut1。
10、第五方面，本专利技术公开了一种角质酶cpcut1，其由上述第三方面所述基因工程菌表达得到。
11、其中，将基因工程菌的种子液以4％～8％v/v接种到含有博来霉素抗性的ypd液体培养基中进行第一培养得到第一菌液，所得第一菌液以0.5％～2％v/v接种到bmgy液体培养基中培养得到第二菌液，所得第二菌液离心得到菌体，所得菌体重悬于bmmy液体培养基中培养，加入乙醇发酵，得到角质酶cpcut1。
12、第六方面，本专利技术公开了上述角质酶cpcut1在解聚聚酯型氨酯塑料中的应用。
13、其中，所述聚酯型氨酯塑料包括水性pu、pba-pu薄膜、固性pu泡沫。
14、其中，所述角质酶cpcut1与水性pu的用量比分别为12μg：0.01-0.09ml，所述角质酶cpcut1与pba-pu薄膜的质量比为0.4：25-35；所述角质酶cpcut1与固性pu泡沫的质量比为0.4：25-35；所述角质酶cpcut1的比酶活为450-460u/mg，如455u/mg。
15、其中，所述解聚的温度为50-60℃；所述解聚的ph为7.5-8.5。
16、综上，本专利技术提供了一种真菌来源的角质酶cpcut1，其能高效解聚聚酯型聚氨酯(pu)塑料，其具有高效催化水解pu塑料酯键的能力。
17、有益效果：
18、(1)本专利技术使用的真菌角质酶cpcut1能够在短时间内高效降解不同类型的聚酯型pu底物(dln，pba-pu和固性pu泡沫)。以dln为底物时，cpcut1在30min后对dln的降解率达到100％；以pba-pu薄膜在12h后的降解率达到40.5％；在以pu泡沫为底物时，cpcut1对pu泡沫的降解率为20.6％。并且发现cpcut1对三种pu的降解效果均优于其他三种已报道的聚酯角质酶。
19、(2)本专利技术鉴定了pu的代谢产物，推测了真菌角质酶cpcut1水解聚酯型pu的水解机制，确定了该酶主要通过作用于pu中的酯键进行水解，为pu塑料酶法解聚技术提供了高效的解聚元件与理论指导。
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1.一种角质酶编码基因cpcut1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述角质酶编码基因cpcut1编码的角质酶CpCut1。
3.一种产角质酶CpCut1的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pMCO-AOXα质粒为载体，以毕赤酵母为宿主，通过克隆角质酶编码基因cpcut1得到。
4.权利要求3所述基因工程菌在产角质酶CpCut1中的应用。
5.一种角质酶CpCut1，其特征在于，由权利要求3所述基因工程菌表达得到。
6.根据权利要求4所述的应用或权利要求5所述角质酶CpCut1，其特征在于，将基因工程菌的种子液以4％～8％v/v接种到含有博来霉素抗性的YPD液体培养基中进行第一培养得到第一菌液，所得第一菌液以0.5％～2％v/v接种到BMGY液体培养基中培养得到第二菌液，所得第二菌液离心得到菌体，所得菌体重悬于BMMY液体培养基中培养，加入乙醇发酵，得到角质酶CpCut1。
7.权利要求5或6所述角质酶CpCut1在解聚聚酯型氨酯塑料中的应用。
8.根据
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述角质酶CpCut1与水性PU的用量比分别为12μg：0.01-0.09mL，所述角质酶CpCut1与PBA-PU薄膜的质量比为0.4：25-35；所述角质酶CpCut1与固性PU泡沫的质量比为0.4：25-35。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述应用，其特征在于，所述解聚的温度为50-60℃；所述解聚的pH为7.5-8.5。
...【技术特征摘要】
1.一种角质酶编码基因cpcut1，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.权利要求1所述角质酶编码基因cpcut1编码的角质酶cpcut1。
3.一种产角质酶cpcut1的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pmco-aoxα质粒为载体，以毕赤酵母为宿主，通过克隆角质酶编码基因cpcut1得到。
4.权利要求3所述基因工程菌在产角质酶cpcut1中的应用。
5.一种角质酶cpcut1，其特征在于，由权利要求3所述基因工程菌表达得到。
6.根据权利要求4所述的应用或权利要求5所述角质酶cpcut1，其特征在于，将基因工程菌的种子液以4％～8％v/v接种到含有博来霉素抗性的ypd液体培养基中进行第一培养得到第一菌液，所得第一菌液以0.5％～2％v/v接种到...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘嘉唯，夏薇，董维亮，徐安明，周杰，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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