【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程应用，涉及金线莲生长发育过程中的一种重要wrky结构-c2-h2蛋白，具体涉及金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6及其编码基因和应用。
技术介绍
1、金线莲[ anoectochilus roxburghii (wall.) lindl.]是兰科开唇兰属多年生草本植物，又名金丝草、金线兰等，是我国珍稀名贵的中药材；其性平、味甘，具有清热凉血、除湿解毒等功效，用于治疗急慢性肝炎、糖尿病等症，享有“药王”的美称。现代研究表明，金线莲中含有多糖、黄酮、有机酸、甾体化合物、生物碱、多种微量元素等化学成分，具有增强免疫、抗肝损伤、降血糖、抗氧化等药理活性，以金线莲为主要原料的中成药，如复方金线莲胶囊、金线莲喷雾剂等，已在临床上用于相关疾病的治疗。随着金线莲在医药、保健、美容及饮用品等诸多领域的广泛应用，国内外市场对金线莲需求量不断上升。然而，金线莲种群由于开花晚、受精后存在胚败育现象，使得种子自然繁殖率低，导致金线莲存在生殖障碍，加之人工过度采挖，使得野生资源锐减。
2、wrky是植物特有的锌指型转录调控因子，其广泛参与调节植物的防御反应和生长发育过程，与花粉发育、种子发育、叶片生长和衰老等过程密切相关。但目前关于wrky蛋白参与金线莲提前开花、叶片与种子发育的研究报道很少。
技术实现思路
1、为了填补金线莲‘金康1号’ arwrky6基因的克隆、表达模式以及金线莲‘金
2、一方面，本专利技术提供了具有促进开花、叶片与种子发育的金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6，上述转录因子arwrky6包括具有如seq id no.2所示的氨基酸序列的多肽（蛋白质）；或由seq id no.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6特征的蛋白质。
3、另一方面，本专利技术提供一种编码上述金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6的编码基因，上述编码基因的核苷酸序列具体为：（a）碱基序列如seq id no.1第1～1545位所示；或（b）与seq id no.1第1～1545位所示的核酸有至少70%的同源性的序列。
4、在本专利技术中，“分离的dna”、“纯化的dna”是指，该dna或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该dna或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
5、在本专利技术中，金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6的编码基因，是指编码具有金线莲‘金康1号’蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如seq id no.1所示的第1～1545位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于seq id no.1所示的第1～1545位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与seq id no.1所示的第1～1545位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出seq id no.2所示的序列。上述编码基因还可以指与seq id no.1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
6、上述编码基因还可以指能编码与天然金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6的相同功能、seq id no.1所示序列的变异形式；这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～120个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为90个以内核苷酸。
7、在本专利技术中，可用实时荧光定量pcr的方法分析金线莲‘金康1号’ arwrky6基因产物的表达模式，即分析金线莲‘金康1号’ arwrky6基因的mrna转录物在细胞中的存在与否和数量。
8、此外，根据本专利技术的金线莲‘金康1号’ arwrky6基因序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选金线莲‘金康1号’ arwrky6基因相关同源基因或同源蛋白。
9、本专利技术的金线莲‘金康1号’ arwrky6基因相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
10、当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
11、此外，还可通过化学合成将突变引入本专利技术蛋白序列中。
12、除了用重组法产生之外，本专利技术蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。可以分别化学合成本专利技术蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
13、本专利技术还提供一种重组表达载体，其包含上述的金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6的编码基因。上述重组表达载体为pcambia1304- arwrky6。
14、本专利技术还提供一种上述的金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6的编码基因在促进金线莲提前开花、促进叶片与种子发育中的应用。
15、上述应用包括：构建含有上述转录因子arwrky6的上述编码基因的重组表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株。
16、有益效果：金线莲作为珍稀名贵中药材，市场需求大。本专利技术首次克隆金线莲‘金康1号’生长发育过程中重要调控转录因子arwrky6的编码序列，并采用荧光实时定量pcr的方法分析 arwrky6基因的表达模式，烟草叶片表皮细胞瞬时表达分析转录因子arwrky6的亚细胞定位，为今后利用基因工程技术调控 arwrky6基因的表达，以促进金线莲提前开花、促进叶片与种子发育及新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。
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1.一种金线莲‘金康1号’WRKY转录因子ArWRKY6，其特征在于，所述转录因子ArWRKY6包括具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
2.一种编码权利要求1所述的金线莲‘金康1号’WRKY转录因子ArWRKY6的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的金线莲‘金康1号’WRKY转录因子ArWRKY6的编码基因。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pCAMBIA1304-ArWRKY6。
5.一种权利要求2所述的金线莲‘金康1号’WRKY转录因子ArWRKY6的编码基因在促进金线莲提前开花、促进叶片与种子发育中的应用。
6.根据权利要求5所述的金线莲‘金康1号’WRKY转录因子ArWRKY6的编码基因在促进金线莲提前开花、促进叶片与种子发育中的应用，其特征在于，所述应用包括：构建含有所述转录因子ArWRKY6的所述编码基因的重组表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株
...【技术特征摘要】
1.一种金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6，其特征在于，所述转录因子arwrky6包括具有如seq id no.2所示的氨基酸序列的多肽。
2.一种编码权利要求1所述的金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的金线莲‘金康1号’wrky转录因子arwrky6的编码基因。
4.根据权利要求3所述的重组表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆晨飞，吴琳，李宇婵，邵清松，孙旭彤，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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