犀牛源性成分的PCR检测引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种脊椎动物源性成分的通用PCR检测引物及检测方法。所述引物的序列为：F‑primer：5’‑TGTTTACCAAAAACATCACCTCCA‑3’；R‑primer：5’‑AGTTAAAGCTCCATAGGGTCT‑3’。本发明专利技术根据GenBank中公布的多种脊椎动物线粒体DNA（mtDNA）序列，在其高度保守区域设计了一对通用型引物并建立通用PCR检测方法，实验结果表明该引物通用性强，实现了对所有收集到样品的有效扩增，结合测序结果实现了对物种的有效鉴定。

PCR primers and their detection methods for rhinoceros derived components

The invention discloses a universal PCR detection primer and a detection method for a vertebrate derived component. The sequence of the primers is F_primer: 5'TGTTTACCAAACATCACCTCCA_3'; R primer: 5'AGTTAAAGCTCCATAGGGGGGTCT_3'. According to the mitochondrial DNA (mtDNA) sequences of various vertebrates published in GenBank, a pair of universal primers is designed in the highly conserved region and a universal PCR detection method is established. The experimental results show that the primers have strong universality and can effectively amplify all collected samples. Effective identification of species.

【技术实现步骤摘要】
犀牛源性成分的PCR检测引物及检测方法
本专利技术属于分子检测
，具体涉及一种犀牛源性成分的PCR检测引物及检测方法。
技术介绍
在生物学史上，犀牛曾遍布全球，其物种将近30个属，据史册记载，我国南部地区曾有大独角犀的分布。两千多年来，犀牛被全人类视为珍稀药用动物，尤其是犀牛角，我国中医研究认为其具有解热、凉血、解痉、解毒、定惊等奇效，外国认为其具有壮阳的效果，阿拉伯地区将犀牛角用于制作成名贵的阿拉伯弯刀刀柄，中国古代也将犀牛皮用于制作士兵铠甲。由于帝制时期对犀牛的过渡猎杀，1922年犀牛在我国已没有分布，因此犀牛未被列入《中国动物分类代码》和《中国国家重点保护野生动物名录》。但根据国际上的物种分类研究，犀牛归类于哺乳纲奇蹄目角型亚目犀科，现存犀牛包括白犀、黑犀、印度犀、爪哇犀和苏门答腊犀五个物种，均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录。1993年国务院发布的第39号文件也明确禁止了犀牛角(包括其任何可辨认部分和含其成份的药品、工艺品等)在我国的进出境、贸易、邮寄、携带、制药等行为。由于犀牛的珍稀和犀牛角的药用价值，在巨大利益的驱使下，猎杀犀牛、贩卖犀牛角等非法行径在全球范围内并不鲜见，印度犀(现存体型最大的犀牛物种)的角在黑市贸易中甚至以每千克250万元人民币的价格出售。现阶段国际上对于犀牛的研究主要集中在物种保护和疾病诊治上，同时由于犀科物种的濒危，国际动物保护组织也已禁止犀牛角的交易，因而世界各国对于检测和鉴定犀牛源性成分的研究非常有限。为进一步加强对现存犀科物种的保护，提高对非法贩卖犀牛角及其制品的打击力度，提升鉴定真假犀牛角及其制品的效率和准确性，建立一种更加合适的对来源于犀牛的可疑样品的分子生物学检测方法是十分必要的。目前对犀牛源性成分DNA检测方面几乎空白，对最重要的犀牛角及其制品的鉴定也只局限于形态观察法、显微镜观察比对法、紫外灯荧光分析法、细胞色素b基因检测法、红外光谱分析法和高效液相色谱法。上述各种方法都存在或主观、或片面、或准确率不高、或应用面不广等弊端。尚无用于鉴定犀牛源性成分的分子生物学检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中所存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种犀牛源性成分的PCR检测引物及检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种犀牛源性成分的PCR检测引物对，是根据犀牛线粒体DNA序列的保守区域设计的。其核苷酸序列如下所示：F：5’-CATCCATAGCCATYATAGCCCT-3’(SEQIDNO.1)，R：5’-CACCAATCTAGGGAGGGT-3’(SEQIDNO.2)。一种犀牛源性成分的PCR检测方法，包括如下步骤：(1)提取样品DNA作为扩增模板，犀牛源性DNA样品作为阳性对照；(2)以上述引物对进行PCR扩增；(3)对PCR产品进行凝胶电泳，根据电泳结果判断样品中是否含有犀牛源性成分。25μLPCR反应体系的组成为：2×TaqPCRMastermix12.5μL，10μmol/L上下游引物各1.0μL，DNA模版2.0μL，补水至25μL。PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。本专利技术的有益效果是：本专利技术根据GenBank中公布的犀牛线粒体DNA(mtDNA)序列，在其高度保守区域设计了一对特异性引物，实验结果表明该引物特异性较好，对犀牛源性样品均能进行特异性扩增，对其他动物样品均未见特异性扩增，且灵敏度较高，能检测到的最低质粒拷贝数量级为102拷贝/μL。本方法可应用于市场上常见犀牛源性成分的快速鉴定。附图说明图1为犀牛样品PCR结果(M:DNAMarkerDL2000；1：犀牛样品；N：阴性对照；B:空白对照)；图2为犀牛源性成分PCR方法特异性试验结果(M：DNAMarkerDL2000；1-14按排列顺序分别为：犀牛、黄牛、水牛、牦牛、羚羊、山羊、绵羊、马、驴、双峰驼、驯鹿、猪、鸡、鸭；N：阴性对照；B：空白对照)；图3为犀牛源性成分PCR方法灵敏度试验结果(M：DNAMarkerDL2000；1-9：梯度依次为109、108、107、106、105、104、103、102、101；N：阴性对照；B：空白对照)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。1材料和方法1.1样品犀牛样品(犀牛角粉末)1份，为本实验室保留样品，13份其它动物样品(黄牛、水牛、牦牛、羚羊、山羊、绵羊、马、驴、双峰驼、驯鹿、猪、鸡、鸭)为本实验室留存样品。以上样品均已使用本实验室标准方法中的脊椎动物通用引物(ZH2006-1，CNAS认可标准)对PCR产物进行克隆测序，已确定其种属来源。1.2主要试剂DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TMTissueDNAKit为美国OMEGA公司产品，TIANGENTaqPCRMastermix为天根生化科技(北京)有限公司产品；DNAMarkerDL2000为TaKaRa产品，购自宝生物工程(大连)有限公司。1.3主要仪器9600PCR仪为美国AppliedBiosystems公司产品；AlphaImagerHP凝胶成像分析系统为美国AlphaInnotech公司产品；Sigma3-18K小型高速冰冻台式离心机为德国Sartorius公司产品；NanoDropND-1000Spectrophotometer紫外分光光度计为美国NanoDropTechnologies公司产品。1.4PCR引物的设计与合成根据GenBank中公布的犀牛(包括白犀、黑犀、印度犀、爪哇犀牛和苏门答腊犀)线粒体DNA(mtDNA)序列，在高度保守区域设计一对犀牛特异性PCR引物。引物序列见表1。表1犀牛引物序列1.5样品的DNA提取及PCR扩增按照DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA。将样品DNA作为模板进行PCR扩增，并对PCR产物进行凝胶电泳。PCR反应体系为25μL：2×TaqPCRMastermix12.5μL，10μmol/L上下游引物各1.0μL，DNA模版2.0μL，补水至25μL。反应程序：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。1.6PCR产物的电泳及测序扩增结束后于2％琼脂糖凝胶和1XTBE缓冲溶液中电泳检测，电压100V，进行30min。待电泳结束后，用AlphaImagerHP凝胶成像分析系统观察电泳后的结果，并将有目的条带的PCR产物进行克隆测序，获得序列后使用美国国家生物技术中心(NCBI)的GenBank数据库的搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)[17]来确定物种来源。1.7PCR方法特异性试验以1份犀牛样品和13份动物样品提取的DNA为模板，使用上文1.5所述反应体系和条件进行PCR扩增、电泳检测，验证所建立的PCR方法的特异性。1.8PCR方法灵敏度试验以犀牛样品模板，使用上文1.5所述反应体系和条件进行PCR扩增、电泳检测后的目的条带送北京六合华大基因科技股份有限公司武汉分公司进行TA克隆测序，并以此重组质粒作为阳性标准品。将重组质粒用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算成目的基因的拷贝数。提取阳性克隆质粒，测定浓度后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犀牛源性成分的PCR检测引物对，其特征在于，所述引物对是根据犀牛线粒体DNA序列的保守区域设计的；所述引物对的核苷酸序列如下所示：F：5’‑CATCCATAGCCATYATAGCCCT‑3’，R：5’‑CACCAATCTAGGGAGGGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种犀牛源性成分的PCR检测引物对，其特征在于，所述引物对是根据犀牛线粒体DNA序列的保守区域设计的；所述引物对的核苷酸序列如下所示：F：5’-CATCCATAGCCATYATAGCCCT-3’，R：5’-CACCAATCTAGGGAGGGT-3’。2.一种犀牛源性成分的PCR检测方法，包括如下步骤：(1)提取样品DNA作为扩增模板，犀牛源性DNA样品作为阳性对照；(2)以权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；(3)对PCR产品进行凝胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵福振，罗宝正，薄清如，邵建宏，廖秀云，沙才华，陈轩，黄海超，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44