一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT‑PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法。所述的检测引物组和检测探针组包括：引物组1和探针组1；或引物组2和探针组2。而本发明专利技术提供的Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法可以实现对常规检测方法难以正常扩增的疑难样品的扩增，因此具有更高的灵敏性的正确性。

A HBV pgRNA real-time fluorescence quantitative RT detection of PCR group, primer probe sets, kit and method

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a virus detection field, more particularly relates to a HBV pgRNA real-time fluorescence quantitative RT detection of PCR group, primer probe sets, kit and method. The detection primer group and the detection probe group include: primer group 1 and probe group 1; or primer set 2 and probe group 2. The method of double amplification polymerase provided Stoffel fragment and Tfl DNA polymerase can achieve amplification of conventional detection methods to difficult samples of normal amplification, hence the correctness is more sensitive.

【技术实现步骤摘要】
一种HBVpgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法
本专利技术属于生物
，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种HBVpgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染呈世界性流行，其感染者已超过二十亿，是我国目前危害最严重的传染病之一。2006年全国乙肝流行病学调查显示，我国目前仍有乙肝表面抗原携带者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万，乙肝和肝癌患者约占全球的四分之一。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌的主要原因，并且每年导致1百余万人死亡，造成极大的社会危害。研究表明，共价闭合环状DNA(cccDNA)，松弛环状DNA(rcDNA)和前基因组RNA(pgRNA)更可能代表活跃的HBV复制活动，它们的检测可用于推断和研究病毒体生产力(VP；rcDNA/cccDNA)，亚病毒颗粒生产力(SVP，HBsAg/cccDNA)和复制活性(RA；pgRNA/cccDNA)。而上述检测指标这些可以用于比较HBeAg阴性和阳性患者之间的相对HBV复制情况差异(赵克开,缪晓辉,ZHAOKe-kai,等.乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义[J].中华肝脏病杂志,2005,13(4):315-317)，从而可用于HBV感染的检测或鉴定。还有研究表明，在HBeAg阳性期内，HBVDNA水平的降低，与较低的HBVcccDNA以及pgRNA水平有强相关性。在HBeAg阴性患者中，ihDNA水平较高，血清中的HBVDNA水平低于预期。较低的HBVDNA/HBsAg比率对应于较低的pgRNA/cccDNA(p<0.01)和较高的S-RNA/cccDNA比率(p<0.0001)，表明HBeAg阴性患者的pgRNA的转录被抑制了(马艳丽,任万华.乙肝病毒cccDNA的研究进展[J].临床肝胆病杂志,2006,22(3):221-222.)。另外，还有研究表明，HBVpgRNA病毒粒子的存在与慢性乙肝(CHB)患者中断NAs药物治疗后病毒反弹的风险相关(JieW,TaoS,HuangX,etal.SerumhepatitisBvirusRNAisencapsidatedpregenomeRNAthatmaybeassociatedwithpersistenceofviralinfectionandrebound[J].JournalofHepatology,2016,65(4):700-710.)。综上所述监控pgRNA水平，可以有效地了解HBV在患者体内的复制情况，进而有效地检测和鉴定HBV感染以及指导乙肝用药。然而，目前对于HBV的核酸检测方法主要集中于HBVcccDNA。例如中国专利申请201410755640公开了一种HBVcccDNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。中国专利申请201410453981公开了一种LAMP法检测石蜡包埋肝组织中HBVcccDNA的引物和试剂盒。中国专利申请201210576370公开了cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒。目前并没有针对HBVpgRNA的商品化的荧光PCR检测试剂盒，而用于HBVpgRNA的检测方法也比较少。例如，中国专利申请201610364652公开了一种检测乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的方法、试剂盒及其应用，其有记载的准确检出的最低检出限为1×103copies/ml。现有技术对HBVpgRNA检测的灵敏度仍不能满足实际需求，其灵敏度仅为1×103copies/ml左右为了有效降低和控制HBV感染造成的经济损失，需要建立一种有效的方法，实现对HBVpgRNA的快速和高灵敏性的检测。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种HBVpgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测方法以及用于检测HBVpgRNA的引物组和探针组及试剂盒。术语：“W/V”指质量-体积浓度。一个方面，本专利技术提供了一种用于检测HBVpgRNA的检测引物组和检测探针组。所述的检测引物组和检测探针组包括：引物组1和探针组1；或引物组2和探针组2。所述的引物组1包括以下4条引物：引物F1：其核苷酸序列为5’-TGGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3’(SEQIDNO：1)，引物R1：其核苷酸序列为5’-CCACCTTATGTGTCCAAGGAATACT-3’(SEQIDNO：2)，引物F2：其核苷酸序列为5’-TTCACCTCACCATACGGCACTCAGGC-3’(SEQIDNO：3)，和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATGAATGTCAGGAAAAGAAGGAGTTTGCC-3’(SEQIDNO：4)。所述的探针组1包括以下两条探针：探针P1：其核苷酸序列为5’-CGCACTCCTCCTGCATATAGACCATCAAA-3’(SEQIDNO：5)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，和探针P2：5’-TCTCAATCGCCGCGTCGCA-3’(SEQIDNO：6)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P1和探针P2应具有相同的荧光基团。所述的引物组2包括以下4条引物：引物F3：其核苷酸序列为5’-TTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGA-3’(SEQIDNO：7)，引物R3：其核苷酸序列为5’-CTTATGTGTCCAAGGAATACTAA-3’(SEQIDNO：8)，引物F4：其核苷酸序列为5’-GTTCACCTCACCATACGGCACTCAGG-3’(SEQIDNO：9)，和引物R4：其核苷酸序列为5’-TGAATGTCAGGAAAAGAAGGAGTTTGCCA-3’(SEQIDNO：10)。所述的探针组2包括以下两条探针：探针P3：其核苷酸序列为5’-TTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCATCA-3’(SEQIDNO：11)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，和探针P4：其核苷酸序列为5’-CTCAATCGCCGCGTCGCA-3’(SEQIDNO：12)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P3和探针P4应具有相同的荧光基团。上述检测引物组和检测探针是根据HBVpgRNA序列特点设计完成的，可用于实时荧光定量RT-PCR技术，实现对HBVcccDNA的检测。另一个方面，本专利技术提供了一种用于检测HBVpgRNA的试剂盒，所述的试剂盒包括上述检测引物组和检测探针组。在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括酶系；所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测HBV pgRNA的检测引物组和检测探针组，其特征在于：所述的检测引物组和检测探针组包括：引物组1和探针组1；或引物组2和探针组2；所述的引物组1包括以下4条引物：引物F1：其核苷酸序列为5’‑TGG TGT CTT TTG GAG TGT GGA T‑3’；引物R1：其核苷酸序列为5’‑CCA CCT TAT GTG TCC AAG GAA TAC T‑3’；其核苷酸序列为5’‑TTC ACC TCA CCA TAC GGC ACT CAG GC‑3’；和引物R2：其核苷酸序列为5’‑ATG AAT GTC AGG AAA AGA AGG AGT TTG CC‑3’(SEQ ID NO：4)；所述的探针组1包括以下两条探针：探针P1：其核苷酸序列为5’‑CGC ACT CCT CCT GCA TAT AGA CCA TCA AA‑3’(SEQ ID NO：5)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，和探针P2：5’‑TCT CAA TCG CCG CGT CGC A‑3’(SEQ ID NO：6)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P1和探针P2应具有相同的荧光基团；所述的引物组2包括以下4条引物：引物F3：其核苷酸序列为5’‑TTT GGT GTC TTT TGG AGT GTG GA‑3’；引物R3：其核苷酸序列为5’‑CTT ATG TGT CCA AGG AAT ACT AA‑3’；引物F4：其核苷酸序列为5’‑GTT CAC CTC ACC ATA CGG CAC TCA GG‑3’；和引物R4：其核苷酸序列为5’‑TGA ATG TCA GGA AAA GAA GGA GTT TGC CA‑3’(SEQ ID NO：10)；所述的探针组2包括以下两条探针：探针P3：其核苷酸序列为5’‑TTC GCA CTC CTC CTG CAT ATA GAC CAT CA‑3’(SEQ ID NO：11)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，和探针P4：其核苷酸序列为5’‑CTC AAT CGC CGC GTC GCA‑3’(SEQ ID NO：12)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P3和探针P4应具有相同的荧光基团。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HBVpgRNA的检测引物组和检测探针组，其特征在于：所述的检测引物组和检测探针组包括：引物组1和探针组1；或引物组2和探针组2；所述的引物组1包括以下4条引物：引物F1：其核苷酸序列为5’-TGGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3’；引物R1：其核苷酸序列为5’-CCACCTTATGTGTCCAAGGAATACT-3’；其核苷酸序列为5’-TTCACCTCACCATACGGCACTCAGGC-3’；和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATGAATGTCAGGAAAAGAAGGAGTTTGCC-3’(SEQIDNO：4)；所述的探针组1包括以下两条探针：探针P1：其核苷酸序列为5’-CGCACTCCTCCTGCATATAGACCATCAAA-3’(SEQIDNO：5)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，和探针P2：5’-TCTCAATCGCCGCGTCGCA-3’(SEQIDNO：6)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P1和探针P2应具有相同的荧光基团；所述的引物组2包括以下4条引物：引物F3：其核苷酸序列为5’-TTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGA-3’；引物R3：其核苷酸序列为5’-CTTATGTGTCCAAGGAATACTAA-3’；引物F4：其核苷酸序列为5’-GTTCACCTCACCATACGGCACTCAGG-3’；和引物R4：其核苷酸序列为5’-TGAATGTCAGGAAAAGAAGGAGTTTGCCA-3’(SEQIDNO：10)；所述的探针组2包括以下两条探针：探针P3：其核苷酸序列为5’-TTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCATCA-3’(SEQIDNO：11)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，和探针P4：其核苷酸序列为5’-CTCAATCGCCGCGTCGCA-3’(SEQIDNO：12)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P3和探针P4应具有相同的荧光基团。2.如权利要求1所述的检测引物组和检测探针组，其特征在于：所述的检测引物组和检测探针组包括：引物组1和探针组1；所述的引物组1包括以下4条引物：引物F1：其核苷酸序列为5’-TGGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3’；引物R1：其核苷酸序列为5’-CCACCTTATGTGTCCAAGGAATACT-3’；引物F2：其核苷酸序列为5’-TTCACCTCACCATACGGCACTCAGGC-3’；和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATGAATGTCAGGAAAAGAAGGAGTTTGCC-3’；所述的探针组1包括以下两条探针：探针P1：其核苷酸序列为5’-CGCACTCCTCCTGCATATAGACCATCAAA-3’(SEQIDNO：5)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，和探针P2：5’-TCTCAATCGCCGCGTCGCA-3’(SEQIDNO：6)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓玮，彭春梅，张嘉，邓可基，李海茵，谢丽娟，李家导，乐小炎，林志豪，罗园香，张新，陈观芝，陈凤英，林敏深，石壮壮，林若琳，王星，王法，余培煜，莫静嫣，
申请(专利权)人：广州海力特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44