检测新型冠状病毒的PCR引物探针组、试剂盒及应用制造技术

本申请公开了检测新型冠状病毒的PCR引物探针组、试剂盒及应用。本申请提供的PCR引物探针组包括检测SARS

【技术实现步骤摘要】
检测新型冠状病毒的PCR引物探针组、试剂盒及应用


[0001]本申请涉及生物检测
，尤其涉及检测新型冠状病毒的PCR引物探针组、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]新冠病毒是目前已知的第七种人类冠状病毒，新冠病毒具有和其他冠状病毒类似的形态特征，病毒颗粒呈圆形或椭圆形，直径60～140nm，有包膜；具有5个必需基因，分别针对核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)；核蛋白(N)包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜(E)，病毒包膜包埋有基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)等蛋白。
[0003][0004]实验室检查新冠病毒包括一般检查、病原学及血清学检查、胸部影像学检查等，其中病原学检查即采用核酸扩增检测方法在鼻、口咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、粪便等标本中检测新型冠状病毒核酸，血清学检查即检测新型冠状病毒特异性IgM抗体、IgG抗体。
[0005]新冠病毒抗原检测方法简单、快捷，但灵敏度一般，适合作为辅助检测手段，抗原检测的敏感性和特异性均较核酸检测差，尤其是敏感性，核酸检测分析敏感性较抗原高约100～1000倍。核酸检测仍然是新冠病毒感染的确诊依据。
[0006]目前已市面上存在各种新冠病毒核酸检测试剂及方法，这些检测试剂检测灵敏度为100～1000copies/mL。但是，新冠核酸检测仍然存在“病毒潜伏期长。
[0007]大部分无症状或者症状轻微的新冠感染者尤其是感染早期病毒载量低，难以被现有上市核酸检测试剂盒检测出，但其传播病毒的能力并不低。加之奥密克戎变异株传播速度快、传染性强、传播隐匿等特点，对开展核酸筛查提出了新的更高的要求。因此，新冠病毒核酸高敏试剂盒和检测方法是新冠病毒感染突发事件应急所需。
[0008]新型冠状病毒具有高度的遗传变异性，开发一种能保证对所有主要变异株均具有高扩增效率的PCR检测试剂盒，是设计PCR检测方法的一大挑战。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本申请的目的是开发一种能够快速、准确检测新冠病毒原始株及各种主要变异株的检测试剂盒及检测方法。通过研究已有的新型冠状病毒核酸序列，选择基因变异少，高度保守的基因区域作为检测的靶标区域。
[0010]本申请通过对目前大量已发现的不同变异株的新型冠状病毒序列进行比对，在相对保守的N基因和ORF1ab基因区域设计多组引物探针，这两个靶标区域比较稳定。新冠病毒是一个RNA病毒，而RNA病毒在病毒复制过程中普遍具有较高的突变频率，针对此现象，本申请针对ORF1ab靶基因筛选出三组引物以及一组探针，针对所检测的N基因的两个靶标区分别筛选出三组引物及一组探针，以增加检测的覆盖能力，可应对潜在的新变异株。
[0011]本试剂盒在ORF1ab基因区域设计了三组引物及一组探针，在N基因的两个靶标区
域分别也设计了三组引物及一组探针，有效提高了检测区段的覆盖度。性能研究表明，本申请方法针对目前5种“需关注的变异株”，包括阿尔法、贝塔、伽马、德尔塔和奥密克戎均可有效检出。上述设计体现了本检测方法的前瞻性，新冠病毒的变异和重组速率不断提高，本检测方法有望应对新流行株的检测。
[0012]第一方面，本申请提供了一种检测新型冠状病毒的PCR引物探针组，所述引物探针组包括：
[0013]用于检测SARS
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CoV
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2ORF1ab基因的O引物探针组，所述O引物探针组包括用于检测SARS
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CoV
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2ORF1ab基因的ORF1ab
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引物组和ORF1ab
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探针组；所述ORF1ab
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引物组包括第一引物组、第二引物组、第三引物组的至少一个引物组；和/或
[0014]用于检测SARS
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CoV
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2N基因的N引物探针组；所述N引物探针组包括用于检测SARS
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CoV
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2N基因的N
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引物组和N
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探针组；所述N
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引物组包括第四引物组、第五引物组、第六引物组的至少一个引物组和/或，第七引物组、第八引物组、第九引物组的至少一个引物组；N
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探针组包括第一N
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探针组和/或第二N
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探针组。
[0015]进一步地，所述第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物；所述第一上游引物包括SEQ ID NO:1～4所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第一下游引物包括SEQ ID NO:5～8所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；
[0016]所述第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物；所述第二上游引物包括SEQ ID NO:9～12所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第二下游引物包括SEQ ID NO:13～16所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；
[0017]所述第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物；所述第三上游引物包括SEQ ID NO:17～22所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第三下游引物包括SEQ ID NO:23～29所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；
[0018]所述ORF1ab
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探针组包括SEQ ID NO:30～35所示核苷酸序列探针中的至少一条，或为其核苷酸序列的互补序列的探针中的至少一条。
[0019]进一步地，所述第四引物组、第五引物组、第六引物组及第一N
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探针组用于检测N基因的A靶标区域；其中，
[0020]所述第四引物组包括第四上游引物和第四下游引物；所述第四上游引物包括SEQ ID NO:36～40所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第四下游引物包括SEQ ID NO:41～45所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；
[0021]所述第五引物组包括第五上游引物和第五下游引物；所述第五上游引物包括SEQ ID NO:46～48所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第五下游引物包括SEQ ID NO:49～53所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；
[0022]所述第六引物组包括第六上游引物和第六下游引物；所述第六上游引物包括SEQ ID NO:54～58所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第五下游引物包括SEQ ID NO:59～63所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；
[0023]所述第一N
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探针组包括SEQ ID NO:64～69所示核苷酸序列探针中的至少一条，或为其核苷酸序列的互补序列的探针中的至少一条。
[0024]进一步地，所述第七引物组、第八引物组、第九引物组及第二N
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探针组用于检测N基因的B靶标区域；其中，
[0025]所述第七引物组包括第七上游引物和第七下游引物；所述第七上游引物包括SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO:78～85所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第八下游引物包括SEQ ID NO:86～93所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第九引物组包括第九上游引物和第九下游引物；所述第九上游引物包括SEQ ID NO:94～98所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第九下游引物包括SEQ ID NO:99～103所示核苷酸序列引物中的至少一条引物；所述第二N
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探针组包括SEQ ID NO:103～108所示核苷酸序列探针中的至少一条，或为其核苷酸序列的互补序列的探针中的至少一条。5.根据权利要求1所述的PCR引物探针组，其特征在于，所述PCR引物探针组中的探针序列5
’
端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、TET中的任一个，探针序列3
’
端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中的任一个。6.一种新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的PCR引物探针组。7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括强阳性质控、临界阳性质控以及阴性质控，所述强阳性质控、临界阳性质控均为包装SARS
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CoV
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2ORF1ab和/或N基因及内标基因片...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱托夫，李海茵，吴彩红，邓可基，
申请(专利权)人：广州海力特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：