本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物及检测方法，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’如SEQ ID NO.2所示。用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将如权利要求1所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。本方法具有方便、准确、高灵敏度的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物及检测方法。
技术介绍
常规测定试猪中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)抗原的方法是将从试猪身上采集的鼻拭子进行培养，再利用培养基分离鉴定，或者通过普通的PCR方法进行检测。其中，培养基分离鉴定法在实际操作中非常繁复，且易受杂菌干扰影响；而普通PCR方法相较于传统的分离鉴定检测法，虽然较为灵敏快捷，但是对目标菌在菌液中的含量以及杂菌数量等方面要求较为严格，且有可能出现假阴性与假阳性等结果，使筛选出的萎缩性鼻炎阴性猪或者感染猪出现偏差；同时，这种方法耗时费力。本专利技术的目的在于:通过设计高特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法，测定试猪鼻拭子中的多杀性巴氏杆菌抗原含量，从而替代普通PCR的方法筛选试猪；并利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测，使试猪筛选更准确和高效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于:设计一对高特异性荧光定量PCR检测引物，便于优化多杀性巴氏杆菌抗原检测，简化待测样本制备工作，从而提高抗原检测效率。本专利技术的目的是这样实现的:一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下: 上游引物:5’ - TGCTCTATCCGCTATTTACCCA - 3’ 如 SEQ ID N0.1 所示； 下游引物:5’ - GCTCAACACACCAAACTCCG - 3’ 如 SEQ ID N0.2 所示。一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将上述所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。有益效果:本专利技术采用的高特异引物，使用荧光定量PCR法，在细菌含量在10CFU时即可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎多杀性巴氏杆菌抗原，具有方便、准确、高灵敏度的特点。【附图说明】下面结合附图对本专利技术作进一步说明。图1为普通PCR对Pm抗原检测图；附图1说明:如图1所示:1:108 CFU Pm菌体；2:107 CFU Pm菌体；3:106 CFU Pm菌体；4:1O5 CFU Pm 菌体；5:1O4 CFU Pm 菌体；6:103 CFU Pm 菌体；7:1O2 CFU Pm 菌体；8:10 CFUPm 菌体；9:1 CFU Pm 菌体；10:Maker2000 ；11:阳性对照。【具体实施方式】实施例1、一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下: 上游引物:5’ - TGCTCTATCCGCTATTTACCCA - 3’ 如 SEQ ID N0.1 所示； 下游引物:5’ - GCTCAACACACCAAACTCCG - 3’ 如 SEQ ID N0.2 所示。一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将上述所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。具体实践验证:荧光定量PCR检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原(多杀性巴氏杆菌)的方法步骤: I抗原检测 1.1制作鼻拭子将竹签一头缠绕脱脂棉，制作鼻拭子，不同日龄的试猪使用相应长度的棉签，制作好的鼻拭子高压灭菌。1.2采样保定试猪，将制作好的鼻拭子轻轻旋转插入试猪鼻孔，避免误伤试猪，取出鼻拭子放入事先分装的BHI培养基中； 1.3菌液制备将接入鼻拭子的BHI培养基放入37°C摇床，在200rpm条件下，过夜培养16h ;另取保存菌种Pm，经过复苏、菌落计数后梯度稀释为不同浓度作为阳性对照。1.4荧光定量PCR将培养好的菌液作为模板，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)配制PCR体系，并使用荧光定量PCR仪(B1Rad公司)进行反应。1.5观察荧光定量PCR结果，将待测样本与阴阳性对照的出峰时间与峰值大小进行对比，记录结果。其中，为便于使用荧光定量PCR方法鉴定多杀性巴氏杆菌抗原，包括待测抗原样本制备与检测引物特异性；其中1、待测样本制备:使用鼻拭子采集试猪鼻腔内菌体，BHI液体培养；2、在多杀性巴氏杆菌基因组高度保守区域内设计高特异性引物如下: 上游引物:5’ - TGCTCTATCCGCTATTTACCCA - 3’ 如 SEQ ID N0.1 所示； 下游引物:5’ - GCTCAACACACCAAACTCCG - 3’ 如 SEQ ID N0.2 所示。(I) RT-PCR 反应体系 SYBR Premix 12.5ul Primer FIul; Primer RIul 模板2ul Water8ul 总体积25ul (2)RT-PCR反应程序 Stage 1:预变性 Raps:1 (95°C 30 秒) Stage 2: PCR 反应 Raps:40 (95°C 5 秒)(59°C 30 秒)Stage 3: Melt Curve (3)普通PCR反应体系 Taqmix12.5ul Primer F 0.5ul Primer R 0.5ul 模板2ul Water9.5ul 总体积25ul (4)普通PCR反应程序 Stage 1:预变性 Raps:1 (95°C 5min) Stage 2: PCR 反应 Raps:30 (95°C 30 秒)(59°C 45 秒)(72°C 30 秒)Stage 3: 4 °C 实时荧光定量PCR所用的试剂盒为TAKARA公司生产。2传统方法对比验证 2.1分离鉴定取步骤1.3制备的菌液，接入不同的分离培养基分离鉴定。2.2普通PCR鉴定使用与步骤1.4同样的模板，用普通PCR进行对比验证，普通PCR结果见附图1。验证结果显示:普通分离鉴定培养法中杂菌大量生长，遮盖了生长速度较慢的产毒型多杀性巴氏杆菌，无法分离；普通PCR法鉴定灵敏度较低，在细菌含量大于13CFU时才能检测到；采用的荧光定量PCR法，在细菌含量在10CFU时即可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原，具有方便，准确，高灵敏度的特点。【主权项】1.一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，其特征在于，所述的引物包括上、下游引物，具体如下: 上游引物:5’ - TGCTCTATCCGCTATTTACCCA - 3’ 如 SEQ ID N0.1 所示； 下游引物:5’ - GCTCAACACACCAAACTCCG - 3’ 如 SEQ ID N0.2 所示。2.一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将如权利要求1所定义的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌的步骤中。【专利摘要】本专利技术属于生物
，特别涉及一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物及检测方法，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’如SEQ ID NO.2所示。用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括将如权本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于多杀性巴氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，其特征在于，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐TGCTCTATCCGCTATTTACCCA‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCTCAACACACCAAACTCCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郝成武，何海，韩端，贺笋，李延涛，何传雨，何玉仙，张淑琴，
申请(专利权)人：新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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