含反义碱基的探针法实时荧光PCR制造技术

含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征是所选的TaqMan及MGB探针的中部序列引入1～2个或以上的反义修饰的2’-O-Methyl碱基，2’-F-RNA碱基；其关键是荧光TaqMan/MGB探针5’端荧光基团标记的正常碱基序列仍能被Taq酶的外切酶活性水解产生荧光，探针因中部的反义碱基而失去了作为PCR扩增模板作用，引物-探针聚合因不能延伸而不能扩增，结合中部同序引物，单独矿物油密闭，消除指数非特异性反应。

Real time fluorescence detection of PCR with antisense bases

Probe real-time fluorescence PCR containing antisense nucleotide, which is characterized in that the middle sequence TaqMan and MGB probes are selected into 1 ~ 2 or more antisense modified 2 '-O-Methyl 2' base, -F-RNA base; the key is a fluorescent TaqMan/MGB probe normal sequence 5 'end labeled with a fluorescent group can still by exonuclease activity Taq enzyme hydrolysis to produce fluorescence probe, the central base of antisense and lost as the template for PCR amplification, amplification by primer probe polymerization could not cannot extend, with the same sequence of central primers, single mineral oil sealed, eliminate nonspecific reaction index.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增
，具体涉及采用反义碱基的探针法实时荧光PCR来减少引物-探针聚合的非特异性的

技术介绍
：早在1953年，核酸DNA双螺旋模型及其中心法则开创了现代分子生物学及奠定了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)的基础，甚至Khorana于1971年就直接提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。但直到1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的KaryMuliis在研究核酸测序技术时产生了指数扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件：模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，经过DNA变性---退火---延伸的循环过程，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子几百万倍。经过一系列探索发展，耐热DNA聚合酶和热循环仪的专利技术与应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR专利技术专利(USPatent4,683,202)。PCR技术以其独有的特异性强、灵敏度高、简便快速和纯度要求低的特点而成为生命科学研究的核心基础技术。但传统的PCR(又称为终末PCR)需将产物凝胶电泳检测进行结果分析，传统的PCR由于PCR产物变异大的局限性，只能检测反应终末产物的定性而不能精确定量，同时也没有解决气雾胶污染、引物二聚体、非特异性扩增等难题，因此传统的PCR结合产物凝胶电泳检测方法不适用于临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。1996年由美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对靶模板进行定量分析的方法。扩增产物荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数即Ct值(Cyclethreshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负线性相关关系，即起始模板稀释一倍达到设定的阈值就要增加一个循环数(Ct)。该技术实行完全闭管式操作，避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性结果的出现，同时也避免了对环境的污染。相比于传统PCR电泳的方法，该技术操作简便，检测结果以更客观的数据形式展现，从而对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，保证了结果的准确性。实时荧光定量PCR扩增产物增加的荧光信号既可通过荧光染料(如SYBRGreenI)显示，又可采用带淬灭基团的荧光探针来检测。染料法即在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于传统PCR引物二聚体非特异性扩增产物干扰的假阳性问题。探针法即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。与染料法相比，探针法在一定程度上避免了假阳性问题的出现，其特异性有引物和探针双重保证，进一步增加了结果的可信度。1995年美国PE公司研制出了Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量PCR技术(LivakKJ，etal.，1995，GenomeRes：4：357-362)，于1997年申请了水解探针(商品名：TaqMan)PCR专利技术专利(USPatent6,485,903)；Epoch公司在水解荧光探针基础上研制了增加结合效率的MGB探针(USPatent7,205,105)，相较于TaqMan探针，该探针大大改善了本底信号的干扰，其较短的探针设计不但增强了淬灭效果，降低了荧光背景，同时能够较好地区分等位基因，可以检测单个碱基的突变(SNP)。2009年，美国的IgorV.Kutyavin提出了一种新的PCR检测技术-Snake系统，该系统通过在一条引物5’端添加一段与该条引物扩增产物探针5’端结合位点前面序列相同的特定碱基片段，使再一次扩增的产物自身3’端能够形成茎环状二级结构，再与探针结合后可作为Taq酶最佳的水解底物，增强了Taq酶5’→3’外切核酸酶的水解效率。不同于TaqMan，Snake系统可以使用较短的探针来改善荧光背景，在信号的产生和序列检测，尤其是单核苷酸检测方面有较强的优势。被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构的改变而被激活，分子信标Molecularbeacon(TyagiS，etal，1996，NatBiotechnol14：303-308)正是这样一种茎环结构的杂交探针，于1999年申请了Molecularbeacon专利技术专利(USPatent05925517)。其它双杂交(FRET)探针，蝎形(Scorpion)探针，Sunrise-Primer，LuxPimers等存在一定的应用局限性，不明显优于水解探针TaqMan方法，且与本专利技术路线、原理不同，这里不再赘述。目前临床检验使用最广的是水解探针TaqMan实时荧光PCR，而基础科研还是广泛使用基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光PCR。然而PCR巨大的放大倍数亦带来非特异性的巨大放大；且各种非特异性都远远赶不上一对引物的指数非特异性扩增，假阳性一直成为PCR应用中挥之不去的固有障碍；一般优化的PCR非特异性反应总在扩增30个循环时显著增加(JannineBrownie，etal，1997，NucleicAcidsResearch25：3235-3241)，这也是传统PCR只进行30个循环反应的原因。低浓度靶分子PCR与实时荧光定量PCR需要40个循环反应。SYBRGreenI染料法实时荧光PCR虽解决了能定量问题，但其引物二聚体也结合染料，一般于Ct30循环开始指数非特异扩增，假阳性遮盖了低浓度(低于5×105copies/反应)靶分子检测定量；不同于染料法，探针法使用的是只能与靶模板特异结合的标记有荧光基团和淬灭基团的一段寡核苷酸，绕过了引物二聚体产生荧光的假阳性问题。探针法PCR虽然引物二聚体不发射荧光信号，但引物二聚体非特异扩增竞争抑制低10倍以上浓度靶分子的同引物扩增(季新成等，2014，中国预防兽医学报36：646-650)，低于34个循环的靶分子被PD抑制，牺牲了灵敏度，而不同引物的双重PCR的靶分子要相差100倍以上时才开始抑制(李杰等，2014，中华流行病毒学杂志6：720-723)，所以引入与靶不同引物的非竞争性内标系统分散了靶引物的二聚体指数扩增而抵消了部分被PD抑制的假阴性(PionzioAM，etal，2014，ForensicSciIntGe本文档来自技高网...

【技术保护点】
含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所选的TaqMan及MGB探针离5’端5至20个碱基的中部序列中引入1至5个反义2’‑O‑Methyl碱基或2’‑F‑RNA碱基；其关键特征在于中部含反义碱基的寡核苷酸荧光TaqMan/MGB探针保留其5’端荧光基团标记的正常碱基序列仍旧能被Taq聚合酶5’外切酶活性所识别、水解；但探针失去了作为PCR扩增模板作用，引物非特异结合探针序列后Taq聚合酶不能识别反义碱基的模板而不能延伸、扩增，从而减少了内源性的引物‑探针的聚合非特异性扩增。

【技术特征摘要】
1.含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所选的TaqMan及MGB探针离5’端5至20个碱基的中部序列中引入1至5个反义2’-O-Methyl碱基或2’-F-RNA碱基；其关键特征在于中部含反义碱基的寡核苷酸荧光TaqMan/MGB探针保留其5’端荧光基团标记的正常碱基序列仍旧能被Taq聚合酶5’外切酶活性所识别、水解；但探针失去了作为PCR扩增模板作用，引物非特异结合探针序列后Taq聚合酶不能识别反义碱基的模板而不能延伸、扩增，从而减少了内源性的引物-探针的聚合非特异性扩增。2.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所述的改良探针法实时荧光PCR采用中部6-8个碱基同序的引物对以减少引物二聚体PD程度，从而减少对靶扩增的竞争性抑制，提高灵敏度。3.根据权利要求1所述的含反义碱基的探针法实时荧光PCR，其特征在于，所述的改良探针法实时荧光PCR探针3’末端添6-8个与其5’端反向...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳素文，何玉贵，江洪，
申请(专利权)人：北京泰格瑞分子检验有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11