一组用于羊源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针制造技术

本发明专利技术提供一组用于羊源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'‑TTTGCGACAATAGCCACAGC‑3'，下游引物：5'‑ATCGGGTGAGGGTAGCTTTGT‑3' ，探针：5'‑TCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAA‑3'，所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。本发明专利技术的引物和探针可对动物饲料和羊肉的羊源性含量进行定性、定量分析，对判断动物饲料和羊肉中羊源性含量具有重要意义，本发明专利技术将在食品检测领域发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一组用于羊源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一组用于羊源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针。
技术介绍
羊肉包括绵羊肉和山羊肉，因其具有天然的滋补功效，长期以来都受到广大消费者的青睐。随着市场流通的日益发达，羊肉经过冷冻、加工后再出售已成为现代市场营销的主要手段，但是羊肉一般经过冷冻，特别是经过加工后的熟羊肉通过感官检查已很难区分真伪，因为一些不法商贩在高额利润的驱使下，在肉制品的生产和销售中利用鸭肉或猪肉以假充真、以次充好，这引起了广大消费者的强烈愤慨。这不仅仅涉及到经济、营养等问题，更直接影响着消费者的健康，尤其是对某些食物过敏的消费者。此外，还会涉及到宗教信仰的问题，如在清真食品中掺杂进猪肉等。目前许多国家已颁布法令禁止将羊源性成分作为蛋白质添加到饲料中。为避免此类事件的发生，人们开始用多种方法检测肉骨粉中的羊源性成分，其中主要包括显微镜检法、近红外光镜法、ELISA法和PCR方法。但随着PCR技术的不断发展，我们发现，科学研究中普遍使用的实时荧光定量PCR方法和普通PCR相比，在羊源性的检测工作中无论是在操作简便性还是反应灵敏度方面都具有更大的优势。实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。在试验中使用了探针检测，随着PCR反应的进行，当合成的新链移动到探针结合位置时，Taq酶将探针切断，探针的完整性遭到破坏，荧光报告基团的荧光信号被释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，同时伴有一个荧光信号的释放。产物与荧光信号产生一对一的对应关系，随着产物的增加，荧光信号不断增强，从而对整个PCR反应过程进行实时和动态的监测分析。本专利技术根据羊特异性线粒体DNA片段，设计合成一对引物，利用引物建立一种运用PCR技术鉴定真假羊肉的方法，并对大量市售羊肉制品进行羊源性成分检测，为保护广大消费者的利益和进一步落实食品质量安全市场准入制度提供了技术保障，也更好地为食品监管部门提供强有力的技术支持。
技术实现思路
本专利技术目的在于设计一组羊源性特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于动物饲料和羊肉中羊源性成分检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本专利技术采用基因克隆技术，将羊源性DNA的cytb基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有cytb基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据羊源性cytb的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。本专利技术的第一个目的是提供了一组用于羊源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'-TTTGCGACAATAGCCACAGC-3'下游引物：5'-ATCGGGTGAGGGTAGCTTTGT-3'探针：5'-TCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAA-3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。作为优选，所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。本专利技术的第二个目的是提供羊源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为羊源性的定性或定量检测试剂盒；所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将羊源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有羊源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述羊源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；作为进一步优选，所述羊源性保守基因片段是以序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：上游引物：5'-CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA-3'下游引物：5'-AATGGTGTAATAAGGGTGGAA-3'；作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。本专利技术的第三个目的是提供上述特异性引物和探针在制备定性或定量检测羊源性的试剂盒中的应用。作为优选，所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术的第四个目的是提供羊源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：（1）制备标准品：将羊源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有羊源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述羊源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；（2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；（3）标准曲线绘制；（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行羊源性的快速定量检测。作为优选，步骤（1）中所述羊源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：上游引物为5'-CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA-3'；下游引物为5'-AATGGTGTAATAAGGGTGGAA-3'；作为优选，PCR扩增所述羊源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min；作为优选，步骤（2）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；作为优选，步骤（2）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术的第五个目的是提供羊源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：（1）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增；（2）通过待测样品的Ct值对羊源性进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴性；作为优选，步骤（1）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；作为优选，步骤（1）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术提供用于对羊源性进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测动物饲料和羊肉中羊源性含量的目的。本专利技术所提供的引物和探针可对动物饲料和羊肉的羊源性含量进行定性、定量分析，对判断动物饲料和羊肉中羊源性含量具有重要意义，本专利技术将在食品检测领域发挥重要作用。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为引物和探针体系优化实验结果；其中，a代表引物为1.6μl，探针为1.6μl；b代表引物为1.0μl，探针为1.6μl；c代表引物为1.0μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于羊源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'‑ TTTGCGACAATAGCCACAGC ‑3'下游引物：5'‑ ATCGGGTGAGGGTAGCTTTGT ‑3'探针：5'‑ TCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAA ‑3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。

【技术特征摘要】
1.一组用于羊源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'-TTTGCGACAATAGCCACAGC-3'下游引物：5'-ATCGGGTGAGGGTAGCTTTGT-3'探针：5'-TCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAA-3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。3.羊源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为羊源性的定性或定量检测试剂盒；其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将羊源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有羊源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述羊源性保守基因片段为序列表中SEQIDNo.2；作为进一步优选，所述羊源性保守基因片段是以序列表中SEQIDNo.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：上游引物：5'-CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA-3'下游引物：5'-AATGGTGTAATAAGGGTGGAA-3'；作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。4.权利要求1或2所述的特异性引物和探针在制备定性或定量检测羊源性的试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述实时荧光定...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，沈颂东，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32