一种检测HLA‑A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合技术

本发明专利技术提出一种检测HLA‑A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合，在使用高特异性MGB探针检测法的基础上，同时结合ARMS(扩增阻滞突变系统)的方法，使检测HLA‑A*31:01等位基因的方法更具特异性。本发明专利技术设计的高特异性扩增HLA‑A*31:01等位基因的引物探针组合如下：上游引物Fp：5’‑GAGCCAGAGGATGGAGCC‑3’下游引物Rp:5’‑CCAGGTCCACTCGGTCtA‑3’探针probe1：5’‑FAM‑aGGCCtGAGTATTGGGAC‑MGB‑3’探针probe2:5’‑VIC‑CCTTCACaTTCCGTGTCTC‑MGB‑3’FAM为6‑carboxyfluorescein；VIC为4,7,2‑trichloro‑7‑phenyl‑6‑carboxyfluorescein；MGB为Minor Groove Binder；此外，使用内参基因ACTB的引物及探针，将目的基因的特异性引物、探针和内参基因的引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应，通过荧光扩增曲线分析结果。本发明专利技术具有简便、灵活快速、特异性高、高通量、无污染、灵敏度高、可实时监测反应等特点，可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA‑A*31:01等位基因的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合
本专利技术属于药物基因组学和基因诊断领域，具体涉及一种检测HLA-A*31:01等位基因的方法。
技术介绍
卡马西平(CBZ)是临床上治疗癫痫和外周神经痛的常用药物。然而,作为临床上最常见的容易诱发药疹反应的药物之一，卡马西平的使用也使患者面临一定的风险。这种药疹反应分为重度的药物不良反应如史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)、中毒性皮肤坏死松解(TEN)以及药物反应伴随的嗜伊红血球过多和系统综合征(DRESS)和轻度的药物不良反应如轻微斑丘疹(MPE)。卡马西平所导致的药疹反应发生率在10％左右，其中重度药疹反应如SJS/TEN的发生率尽管比较低(1-35/万)，但致死率可高达30-50％。有研究表明，人类白细胞抗原(HLA)家族的等位基因HLA-A*31:01与卡马西平所导致的药疹反应密切相关。对欧洲人群的研究表明，HLA-A*31:01等位基因的存在会使患者发生药疹反应的风险增加5％～26％。而在日本人群中，发生药疹反应的患者携带HLA-A*31:01等位基因的频率远远高于正常人(60.7％vs12.5％，P＝3.64×10-15)[1]。此外，有研究表明在中国汉族人群中HLA-A*31:01虽然与卡马西平导致的SJS/TEN没有相关性，但其与卡马西平用药导致的MPE/DRESS有密切的相关性(25.8vs2.8％，P＝0.0021)[2,3]。在中国汉族人群中，HLA-A*31:01等位基因的携带率高至7.1％。因此，在卡马西平用药之前，进行HLA-A*31:01等位基因的检测非常必要，对于HLA-A*31:01阳性患者应尽量避免使用卡马西平进行治疗。HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码，现已发现9000多个等位基因，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个；鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。目前，HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法，主要包括PCR-SBT(PCRSequence-basedTyping,基于测序分型的聚合酶链式反应PCR-SSOP(SequenceSpecificOligonucleotideProbes，序列特异性寡核苷酸探针分型)和PCR-SSP(Sequence-specificprimers，序列特异性引导的聚合酶链式反应)。其中，PCR-SBT直接测序法更是国际上公认的HLA基因分型方法的“金标准”。此类方法具有灵敏度高，特异性强，样本需求量少等优点。但是，拥有众多优点的同时，此类方法也存在着操作繁琐，耗时长，成本高昂，而且测序结果会出现套峰，不利于结果的判读，使得PCR-SBT法存在着模棱两可的结果等缺点。尤其，操作繁琐、耗时长等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测需要，不适应现代医学检验所要求的“快速、简便”的理念。此外，PCR-SSOP即序列特异性寡核苷酸探针，首先是对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中对产物进行标记，然后针对扩增产物设计系列寡核苷酸探针固定在膜上，最后将产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号判断实验结果。该技术为传统的分型技术，灵敏度高、特异型较强，且需要样本量少；但是由于其所用的载体大多为膜或微滴定板，对于复杂的HLA等位基因来说，它不具有集成化的优点，而且洗脱条件比较繁琐，耗时较长，难以标准化和自动化。PCR-SSP即序列特异性引物PCR技术，适用于广泛临床监测。其原理是根据已知HLA基因序列设计特异性引物，直接PCR扩增基因组DNA后通过凝胶电泳检测产物，根据产物有无和片段大小来判断HLA基因型。该技术简便、技术条件容易掌握，需要样本量少、对血液条件要求不高，适用于临床对于已知HLA序列的快速检测应用等优势；然而由于PCR-SSP技术需要进行凝胶电泳实验，因此该技术在操作过程中易造成二次污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假阳性结果。这些传统的HLA等位基因检测方法远远不能满足日益增长的检测需求及灵活性。因此，需要建立一种简单、可靠、灵敏、高特异性的检测HLA-A*31:01等位基因的方法。[1]OzekiT,MushirodaT,YowangA,etal.Genome-wideassociationstudyidentifiesHLA-A*3101alleleasageneticriskfactorforcarbamazepine-inducedcutaneousadversedrugreactionsinJapanesepopulation[J].Humanmoleculargenetics,2011,20(5):1034-41.[2]HungSI,ChungWH,JeeSH,etal.Geneticsusceptibilitytocarbamazepine-inducedcutaneousadversedrugreactions[J].Pharmacogenetics&Genomics,2006,16(4):297-306.[3]GeninE,ChenDP,HungSI,etal.HLA-A*31:01anddifferenttypesofcarbamazepine-inducedseverecutaneousadversereactions:aninternationalstudyandmeta-analysis[J].PharmacogenomicsJournal,2014,14(3):281-8.
技术实现思路
本专利技术研发出一套适宜于实时荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*31:01等位基因的引物探针组合，并且在现已有的实时定量PCR检测HLA分型的基础上，提供一种更加简便、快速、高通量、特异性高的可以定性检测HLA-A*31:01等位基因分型的方法，以克服现有检测技术所存在的缺陷。此检测方法更易于在临床的推广和应用，从而更加有利于HLA-A*31:01等位基因分型指导下的卡马西平和奥卡西平安全用药。在研究本专利技术时，申请人通过与HLA-A中3000个其它等位基因序列的对比，进行HLA-A*31:01等位基因特异性位点和引物设计区域的确定，它们主要位于HLA-A等位基因第2外显子，然后根据特异性位点附近的区域，结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法，设计特异性引物以及MGB探针，值得注意的是探针和引物设计的位置能够排除其它HLA-A等位基因的结合、识别，尤其是HLA-A*30:01和HLA-A*32:01等位基因。采用MGB探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带HLA-A*31:01等位基因。本专利技术的技术方案具体如下：用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*31:01等位基因的引物探针组合，包括以下目的基因的特异性引物和探针，其序列如下：上游引物Fp：5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’；下游引本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA‑A*31:01等位基因的引物探针组合，其特征在于，包括以下目的基因的特异性引物和探针，其序列如下：上游引物Fp：5’‑GAGCCAGAGGATGGAGCC‑3’；下游引物Rp:5’‑CCAGGTCCACTCGGTCtA‑3’；该下游引物Rp序列的倒数第二位小写字母t表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性，并且倒数第一位碱基A为HLA‑A*31系列等位基因所含有的特异性碱基；探针probe1：5’‑FAM‑aGGCCtGAGTATTGGGAC‑MGB‑3’；小写字母a、t表示的碱基为具有特异性的碱基；探针probe2:5’‑VIC‑CCTTCACaTTCCGTGTCTC‑MGB‑3’；小写字母a表示的碱基为能够区分HLA‑A*31:01等位基因和其它HLA‑A*31等位基因的特异性碱基；其中FAM为6‑carboxyfluorescein；VIC为4,7,2′‑trichloro‑7′‑phenyl‑6‑carboxyfluorescein；MGB为Minor Groove Binder；还包括针对内参基因设计的特异性引物和探针。

【技术特征摘要】
1.用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA-A*31:01等位基因的引物探针组合，其特征在于，包括以下目的基因的特异性引物和探针，其序列如下：上游引物Fp：5’-GAGCCAGAGGATGGAGCC-3’；下游引物Rp:5’-CCAGGTCCACTCGGTCtA-3’；该下游引物Rp序列的倒数第二位小写字母t表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性，并且倒数第一位碱基A为HLA-A*31系列等位基因所含有的特异性碱基；探针probe1：5’-FAM-aGGCCtGAGTATTGGGAC-MGB-3’；小写字母a、t表示的碱基为具有特异性的碱基；探针probe2:5’-VIC-CCTTCACaTTCCGTGTCTC-MGB-3’；小写字母a表示的碱基为能够区分HLA-A*31:01等位基因和其它HLA-A*31等位基因的特异性碱基；其中FAM为6-carboxyfluorescein；VIC为4,7,2′-trichloro-7′-phenyl-6-carboxyfluorescein；MGB为MinorGrooveBinder；还包括针对内参基因设计的特异性引物和探针。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述内参基因为ACTB，相应设计的特异性引物和探针，作为内质控体系，其序列如下：上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’；下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’；探针Actin-probe:5’-CY5-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’；其中，CY5为Cyaninedyes5；BHQ2为BlackHoleQuencher-2。3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备针对HLA-A*31:01等位基因的检测试剂盒方面的用途。4.一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王会娟，刘正斌，张婷婷，康星，陈超，
申请(专利权)人：陕西佰美基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61