本发明专利技术涉及动物医学的分子生物学和生产领域，具体涉及检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示，特异性、重复性好，灵敏度高。本发明专利技术还公开了以所述引物建立的检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法；能够快速区分大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的单独或混合感染导致的猪肠炎；能够快捷、有效地鉴别诊断，有利于制定针对性的防控措施，对临床生产猪细菌性肠炎的免疫防控，保障养猪生产平稳进行。
【技术实现步骤摘要】
一种检测猪细菌性肠炎病原的多重PCR特异性引物及其应用
本专利技术涉及动物医学的分子生物学领域，具体涉及检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物及其应用。
技术介绍
猪细菌性肠炎在临床生产中长期存在，并导致生长速度减慢和大量死亡。引起猪肠炎的病原主要为大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌，其中大肠杆菌导致仔猪黄白痢、断奶仔猪腹泻和肠道水肿等；沙门氏菌导致仔猪副伤寒和育肥猪拉稀等；产气荚膜梭菌导致仔猪红痢和肥猪阶段肠道胀气等。猪细菌性肠炎病程短，传播快，病情发展迅速，死亡率高。猪大肠杆菌在猪群中引起很多疾病，包括新生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻和肠道黏膜下层水肿。由于发病率、死亡率和体重降低的增加，以及治疗、疫苗和饲料添加剂的成本增加，大肠杆菌引起的腹泻和水肿病造成了巨大的经济损失。猪沙门氏菌多爆发于断奶的幼崽猪群，临床症状主要表现为小肠结肠炎、腹泻及脱水。本病常发生于感染了大剂量沙门氏菌，免疫抑制，且体质虚弱及卫生条件差的猪群。临床急性发病猪，其排菌可达每克粪便含106个猪霍乱沙门氏菌(SmithHW,JonesJET.1967.JPathol93:141-156.)或107个鼠伤寒沙门氏菌(GutzmannF,LaytonH,SimiinsK,etal.1976.AmJVetRes37:649-655.)。猪产气荚膜梭菌病在世界范围内流行，其病原梭菌是一类严格厌氧的革兰氏言行产芽胞杆菌，其中引起肠炎的主要为C型和A型产气荚膜梭菌。其中C型产气荚膜梭菌病例通常出现在仔猪出生以后3天，增殖快，世代间隔短，在数小时内，可以增殖到108-109个/g(OhnunaY,KondoH,etal.1992.JJpnVetDiagnInvest14:258-259)，感染仔猪迅速转变为虚脱，勉强运动，然后很快转并为濒死期，多数病例会在出生后12-36h死亡。A型产气荚膜收集是猪肠道内正常微生物区细的组成部分，一旦条件适宜就大量增殖，引起新生仔猪、偶尔也可以引起断奶仔猪的肠道疾病。大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌这三种病原菌也是人畜共患的感染原，人群极易通过接触或食用带菌的食物而感染，尤其是对老人小孩人群，感染后会引发消化道炎症、出血性腹泻、败血症、伤寒等病症，伤害极大。目前实验室对大肠杆菌和沙门氏菌进行有氧培养，对产气荚膜梭菌进行厌氧培养，并且分别进行三种病原菌的生化试验或者单病原PCR鉴定。培养过程耗时较长且目标盲目，尤其厌氧培养对硬件和操作熟练度要求高，而单病原PCR鉴定需要对三种病原分别进行检测耗时长试剂使用量大。综上所述，现有技术还存在较大不足。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物及利用该引物建立的检测方法，特异性强和敏感性高，可满足临床上简便、快速、准确进行区分鉴定的要求，为临床生产对该病的免疫防控提供依据。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:6所示。进一步的，所述引物的模板基因为大肠杆菌uidA1和uidA2基因、沙门氏菌invA1和invA2基因、产气荚膜梭菌clo1和clo2基因。一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的试剂盒，包含上述多重PCR特异性引物。进一步的，所述试剂盒还包括：PCR预混液、无菌双蒸水；所述PCR预混液包括：DNA聚合酶、pH8.3BufferTris-HCl、KCl、MgCl2、dNTPMixture。进一步的，所述特异性引物在猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌检测中的应用。一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法，包括：利用所述引物对待检样品进行PCR扩增；收集扩增产物进行电泳实验；判读电泳结果。所述PCR反应体系包括：PCR预混液12.5μL、引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2各1μL、引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4各0.5μL、引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:6各1.5μL、无菌双蒸水6.5μL；所述引物的浓度均为10pmol；所述PCR反应条件为：93～95℃预变性5min～10min；93～95℃变性30s，48～56℃退火30s，70～72℃延伸60s，30个循环；最后70～72℃终延伸7min～10min。进一步的，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min；然后95℃30s，55℃30s，72℃60s，共进行30次循环；最后72℃延伸7min。进一步的，所述PCR预混液包括：DNA聚合酶1.25U/25μL、pH8.3BufferTris-HCl20mM、KCl100mM、MgCl23mM、dNTPMixture各0.4mM。进一步的，所述电泳检测为琼脂糖凝胶电泳检测。本专利技术有益效果：本专利技术实施例的有益效果是：本专利技术根据大肠杆菌uidA基因、沙门氏菌invA基因和产气荚膜梭菌a毒素基因的分析并设计引物能扩增不同长度片段的这一特点，建立一种用多重PCR方法快速鉴别诊断引起猪肠炎性的大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌单独或者混合感染的方法，特异性强和敏感性高，可满足临床上简便、快速、准确进行区分鉴定的要求，为临床生产对该病的免疫防控提供依据。附图说明图1：样品检测电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别为阴性对照、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌+沙门氏菌、产气荚膜梭菌+大肠杆菌、沙门氏菌+大肠杆菌、产气荚膜梭菌+大肠杆菌+大肠杆菌。图2：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法的特异性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别为阴性对照、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌。图3：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测大肠杆菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7分别表示待检样品中大肠杆菌DNA含量为0、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。图4：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测沙门氏菌杆菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7分别表示待检样品中沙门氏菌DNA含量为0、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。图5：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测产气荚膜梭菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中产气荚膜梭菌DNA含量为0、103CFU、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。图6：猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌多重PCR扩增方法检测模拟猪肠道感染的大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌敏感性检验电泳图，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌样本DNA含量各为0、103CF本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:6所示。2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述引物的模板基因为大肠杆菌uidA1和uidA2基因、沙门氏菌invA1和invA2基因、产气荚膜梭菌clo1和clo2基因。3.一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的特异性引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR预混液、无菌双蒸水；所述PCR预混液包括：DNA聚合酶、pH8.3BufferTris-HCl、KCl、MgCl2、dNTPMixture。5.权利要求1或2所述特异性引物在猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌检测中的应用。6.一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法，包括：利用所述引物对待检样品进行PCR扩增；收集扩增产物进行电泳实验；判读电泳结果；所述PCR反应体系包...
【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，宋延华，潘永飞，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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