一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法。本发明专利技术提供的提高核移植胚胎体外发育效率的方法，包括：将激活后的核移植重构胚，转入含BET蛋白抑制剂(+)‑JQ1的胚胎培养液中培养。本发明专利技术方法可以抑制细胞定向转录记忆，促进了核移植胚胎重编程，从而提高体细胞核移植胚胎的体外发育效率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法。
技术介绍
自从1997年首例体细胞克隆哺乳动物“多莉”羊出生以来，陆续有克隆动物出生的报道，然而，克隆动物的整体效率仍然较低。在所有通过体细胞核转移(SCNT)生产的哺乳动物中，有缺陷的表观遗传重编程可能是低成功率的主要原因。组蛋白修饰和DNA甲基化是阻碍体细胞重新编程成为多能状态的主要因素。研究表明，与体内受精胚胎相比，体细胞核移植胚胎中出现了大量异常DNA和组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化模式。表观遗传异常可导致早期胚胎发育异常的基因表达，导致克隆动物出生率较低，也易出现较多的畸形如大舌头、八字脚等，导致克隆动物存活率较低。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种体细胞核移植胚胎的处理方法，以此来提高体细胞核移植胚胎的质量，从而提高体细胞核移植效率。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供的提高核移植胚胎体外发育效率的方法，包括：将激活后的核移植重构胚，转入BET蛋白抑制剂的胚胎培养液中培养。进一步的，所述BET蛋白溴抑制剂在培养液中浓度为10-20nM，最佳浓度为10nM。进一步的，所述BET蛋白抑制剂为(+)-JQ1；所述(+)-JQ1分子式：C23H25ClN4O2S，结构式为：进一步的，所述激活后的核移植重构胚，在含BET蛋白抑制剂的PZM-3胚胎培养液中培养时间为48-72h，优选72h。进一步的，所述重构胚在含BET蛋白抑制剂的PZM-3胚胎培养液中培养后，再换为PZM-3胚胎培养液继续培养至144-168h，优选168h。进一步的，所述培养条件为38.5-39℃、5％O2、5％CO2、90％N2和饱和湿度。进一步的，所述核移植胚胎可以包括所有哺乳动物，包括但不局限于猪、牛、羊、鼠、人的核移植胚胎。本专利技术有益效果：BET蛋白家族具有调控体细胞定向表达的功能，克隆胚胎构建后供体细胞受卵母细胞的重编程，它的定向表达记忆“抵抗”了卵母细胞的重编程，造成克隆效率低下，重编程中一个关键事件就要擦除供体细胞的转录记忆，使其由定向表达转为多功能表达。(+)-JQ1是一种高度特异的BET蛋白抑制剂，尤其对BRD4具有高度的选择性。因此使用BET蛋白抑制剂(+)-JQ1处理克隆胚胎，抑制了BET蛋白的作用，降低了这种“抵抗”性，从而抑制了供体细胞的转录记忆，促进了核移植胚胎重编程，提高体细胞核移植胚胎的体外发育效率。具体实施方式为了更好的说明本专利技术技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本专利技术技术方案包含但不限于以下实施方式。本专利技术实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的或常规的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。本申请中单位“M”表示“mol/L”；“nM”表示“nmol/L”。实施例1核移植和重构胚融合激活本实施例以猪核移植胚胎构建为例：1、供体细胞分离和培养供体细胞来源于广东温氏集团特级公猪耳组织，剪取猪耳皮后放入DMEM培养液4℃保存运回实验室，将猪耳皮组织块剪碎后，用DMEM清洗组织碎片后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养。5-7h后添加含10％胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至90％汇合时进行传代，用传至第2代的体细胞作为核移植的供体细胞。2、卵母细胞收集和成熟培养从屠宰场母猪获取的卵巢，放入37℃生理盐水内运回实验室，使用添加抗生素的生理盐水冲洗3遍后，用配有18G针头的10mL注射器抽取2-6mm的卵泡，在体视显微镜下用自制捡卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液洗2遍，然后放入已在CO2培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中，在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养44h。将成熟培养后的COCs与0.1％透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，去除卵丘细胞的卵母细胞挑选出卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞进行克隆胚胎的构建。3、体细胞核移植和重构胚融合激活成熟的卵母细胞使用荧光照射的方法确定核的位置，使用显微操作针精确移除卵母细胞核，并在卵周隙注入一个体细胞完成胚胎重构过程。将重构卵分批放入已经铺满激活液的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，用100v/mm、80μs、2次脉冲直流电诱导融合同时激活。将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤后，转入预平衡的含有5μg/mlCB的胚胎培养液培养4h，然后将获得的核移植胚胎按本专利技术的方法进行进一步培养。实施例2(+)-JQ1不同浓度处理对核移植胚胎体外发育的影响2.1实验设计对照组：将施例1操作后得到的核移植胚胎放入PZM-3培养液中培养至168h。实验组：将施例1操作后得到的核移植胚胎分别放入含有1nM、10nM、15nM、20nM和50nM(+)-JQ1的5组PZM-3培养液中分别培养72h，之后分别转移至不含(+)-JQ1的PZM-3培养液中继续培养到168h。2.2克隆胚胎体外培养与囊胚细胞计数克隆胚胎培养条件为39℃、5％O2、5％CO2、90％N2和饱和湿度。在培养第2天和第7天分别观察记录卵裂和囊胚发育情况。将第7天的囊胚用4％多聚甲醛固定10min，再用10mg/LHoechst33342中染色10min，压片后在荧光显微镜下观察记录囊胚细胞数。使用SPSS软件对实验数据进行方差分析，比较不同浓度处理组和未处理组的胚胎早期发育情况，包括胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的差异(结果详见表1)。表1(+)-JQ1不同浓度处理对核移植胚胎体外发育的影响组别克隆胚胎数(重复次数)卵裂率(％)囊胚率(％)囊胚总细胞数对照组241(4)74.27±3.549.13±2.80a37.95±3.35(+)-JQ1(1nM)154(4)77.27±5.849.09±3.68a31.28±3.61(+)-JQ1(10nM)240(4)76.25±2.2115.42±3.38b38.47±2.86(+)-JQ1(15nM)239(4)76.22±3.1114.67±3.08b38.86±3.90(+)-JQ1(20nM)240(4)79.13±2.4715.03±3.86b37.89±2.74(+)-JQ1(50nM)240(4)77.92±2.937.92±3.27a36.50±5.86备注：统计分析4次重复试验的数据，计算其平均值±标准差，同一列的不同小写字母表示差异显著(P＜0.05),下同。结果表明，使用10nM(+)-JQ1处理猪核移植胚胎，可以显著提高猪克隆胚胎的体外发育效率，其168h的囊胚率显著高于对照组。实施例3(+)-JQ1不同处理时间对核移植胚胎体外发育的影响3.1实验设计对照组(同实施例2)：将实施例1操作后得到的核移植胚胎放入PZM-3培养液中培养至168h。实验组：将实施例1操作得到的核移植胚胎放入含有10nM(+)-JQ1的PZM-3培养液中分别培养24h、48h、72h和120h，之后转移至不含(+)-JQ1的PZM-3培养液中继续本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法，其特征在于，包括：将激活后的核移植重构胚，转入含BET蛋白抑制剂的胚胎培养液中培养。

【技术特征摘要】
1.一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法，其特征在于，包括：将激活后的核移植重构胚，转入含BET蛋白抑制剂的胚胎培养液中培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BET蛋白抑制剂在培养液中浓度为10-20nM。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活后的核移植重构胚，在BET蛋白抑制剂的胚胎培养液中培养时间为48-...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珍芳，石俊松，许卫华，周荣，罗绿花，麦然标，蔡更元，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44