一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法，该方法包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L‑myc基因的重组慢病毒载体；(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)选取合适浓度病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。本发明专利技术永生化细胞系的制备方法是一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略；制备的永生化人源神经干细胞系具有原代神经干细胞的所有生物学特征，同时也具有正常的三系分化特性，可以成功分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，同时该细胞系的生长速度及成神经球的能力较原代细胞强，成功传代20代以后依然可以快速增殖，并且无致瘤性。

An immortalized human neural stem cell line and its preparation method

The invention discloses an immortalized human neural stem cell line and its preparation method, which comprises the following steps: (1) isolation and culture of primary human hippocampal neural stem cells; (2) construction of recombinant lentivirus vector containing L myc gene; (3) packaging production of the recombinant lentivirus and collection of supernatant; (4) selection of appropriate concentration. Stem cells were transfected and screened by virus supernatant and immortalized human neural stem cell lines were constructed. The preparation method of the immortalized cell line of the invention is a new stable and safe and effective immortalized coding strategy; the immortalized human neural stem cell line prepared has all the biological characteristics of the primary neural stem cells, and also has normal three-lineage differentiation characteristics, and can successfully differentiate into neurons and astrocytes. Oligodendrocyte and oligodendrocyte, at the same time, the growth rate and the ability of neuroblasts of this cell line are stronger than those of primary cells. After 20 generations of successful passage, it can still proliferate rapidly and has no tumorigenicity.

【技术实现步骤摘要】
一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法
本专利技术属于细胞生物学及神经科学
，具体涉及一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法。
技术介绍
神经干细胞(Neuralstemcells,NSCs)起初被认为只存在于出生前及出生后不久，近来证据表明其同样存在于成人的侧脑室下层和海马齿状回处，具有分化为神经元、星形胶质和少突胶质细胞的多向潜能，能自我更新、具有低免疫原性和良好的组织相容性。由于NSCs可以提供各种神经细胞来维持和修复损伤的脑组织，因此被认为是治疗神经系统疾病的良好工具和最具希望的天然资源。众多临床前研究均已证实了移植外源性神经干细胞可以在疾病如缺血性脑卒中中具有一定的治疗效果。然而神经干细胞在进行临床转化之前还有一些实际关切的重要问题有待解决，其中主要的如细胞的代谢衰老问题，随着培养细胞的正常增殖、分化，体外培养难以获得大量的同质细胞，反复提取和输注细胞又同时增加了成本、安全和伦理问题。因此，目前研究认为对移植细胞进行永生化处理是一个很好的策略，可以为基础研究和临床转化提供大量的同质可靠的种子细胞。永生化(immortalization)细胞是指细胞处于连续周期中而停止发育进程。目前细胞的永生化方法主要是通过基因改造，如通过病毒载体将编码癌基因蛋白的基因导入目的细胞中，使细胞获得长期传代的能力。目前对细胞进行永生化用的较多的方法是将不同形式的c-myc、p53、腺病毒EIA、端粒酶hTERT以及SV40大T抗原导入早期阶段的细胞内制成永生化细胞系，其中c-myc和SV40大T抗原的使用最为广泛。然而目前这些细胞永生化的方法还不够稳定，或者伴有潜在的致癌风险，如单独的hTERT基因导入或不足以永生化，联合SV40抗原又增加编码的复杂性和潜在致瘤风险。目前国际上使用的两株临床级永生化神经干细胞系HB1.F3.CD21NSCs和CTX0E03NSCs，均是在2006年前通过高度致癌基因v-myc/c-myc编码生成。近来研究逐渐发现myc基因中L-myc亚型也可以表现出一定的编码潜能，且比其他myc具有更低的肿瘤源性和稳定性。因此，我们计划研究利用新型的L-myc基因来对人源NSCs进行永生化编码，探讨编码后的永生化NSCs和原代NSCs间的生物学特性，发展一种新的安全有效的永生化编码策略，以满足未来神经干细胞的基础研究和临床转化需求。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法。本专利技术发展一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略，利用新型L-myc编码基因来构建一种永生化的人源神经干细胞系，以满足未来在神经干细胞及神经系统疾病上的基础研究甚至临床转化需求，克服现有的技术不足及目前编码永生化细胞策略中的潜在致瘤风险。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag；(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)选取合适浓度慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。其中，步骤(1)所述分离培养原代人海马来源神经干细胞的具体步骤为：(A)收集自然流产终止妊娠的3月胎儿脑组织；(B)显微分离获取海马，浸于培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化，离心，用完全培养基重悬，过滤网，分瓶培养，换液传代，培养到第3代(P3代)，第3代时用于慢病毒转染；(C)取1代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1的Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG的Marker表达。其中，步骤(2)所述构建含L-myc基因的重组慢病毒载体为选用空载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，在EcoRI位点插入的L-myc基因，有效片段，对重组质粒载体进行测序鉴定。其中，对重组质粒载体进行测序鉴定的正向测序引物为(SEQIDNO.1)CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；反向测序引物为(SEQIDNO.2)WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA。其中，步骤(3)所述慢病毒包装生产及上清液收集为对步骤(2)构建好的重组慢病毒载体进行大量抽提，用293T细胞进行转染后收集病毒上清。其中，步骤(4)所述转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系的具体步骤为：(A)选择P3代人海马来源神经干细胞进行L-myc基因的慢病毒感染，于层粘连蛋白预处理过的6孔板中铺40-50万细胞后，在第二天加入慢病毒上清液，慢病毒转染主要看MOI值，本专利技术采用慢病毒上清液的MOI值为3，因为病毒不同滴度、不同细胞量和培养基的多少加入的慢病毒剂量是不一定的，本专利技术换算成MOI值就是3。MOI值＝病毒滴度(TU/mL)×病毒加样体积(mL)/细胞个数；(B)感染后用嘌呤霉素进行筛选稳转株，于6孔板中筛选成功构建永生化的人源神经干细胞系；(C)分别提取永生化干细胞的蛋白和RNA分别进行westernbolt和qRT-PCR实验鉴定永生化细胞系中L-myc蛋白或基因的表达。本专利技术所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法所制备的永生化人源神经干细胞系。本专利技术所述用于制备永生化人源神经干细胞系的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag，其特征在于，所述载体含有L-myc基因的重组慢病毒载体。其中，对永生化的干细胞系进行扩增传代培养，检测干细胞的增殖能力和三系分化情况；同时需要对永生化干细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验评估永生化后的干细胞的致瘤潜能，并用人胶质瘤细胞系U251作为阳性对照。本专利技术制备方法具体实施步骤为：1、分离培养原代人海马来源神经干细胞。收集自然流产终止妊娠的3月左右胎儿脑组织；显微分离获取海马，浸于生理盐水或DMEM/F12培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化5-10分钟，离心，用完全培养基(DMEM/F12+2％B27+20ng/mlEGF+20ng/mlbFGF+2nML-glutamine+2μg/mlHeparinsodium+1％penicillin-streptomycin)重悬，过400目滤网，分瓶培养，3天换液，7天传代；取1-3代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1等Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG等marker表达。2、构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag。查询L-myc的GenBankID为NM_001033081；选用空载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，在EcoRI位点插入的L-myc基因，有效片段大小为1095bp；对重组质粒载体进行测序鉴定。L-myc基因(SEQIDNO.3)：ATGGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L‑myc基因的重组慢病毒载体pLenti‑EF1a‑EGFP‑P2A‑Puro‑CMV‑MYCL‑3Flag；(3)对重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)采用慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag；(3)对重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)采用慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。2.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分离培养原代人海马来源神经干细胞的具体步骤为：(A)收集自然流产终止妊娠的3月胎儿脑组织；(B)显微分离获取海马，浸于培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化，离心，用完全培养基重悬，过滤网，分瓶培养，换液传代；(C)取第1代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1的Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG的Marker表达。3.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述构建含L-myc基因的重组慢病毒载体为选用空载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，在EcoRI位点插入的L-myc基因，有效片段，对重组质粒载体进行测序鉴定。4.根据权利要求3所述的永生化人源神经干细胞系的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈陆馗，张桂龙，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32