本发明专利技术设计间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性因子的分离与制备方法。通过干细胞培养的上清液和培养的干细胞，将其细胞破碎，提取干细胞中的干细胞活性因子。分离制备的干细胞活性因子在再生医学(包括恶性肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有广阔的应用前景，并将产生重大的社会效益和巨大的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利设计。通过间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞培养的上清液和培养的干细胞，将其细胞破碎，提取间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞中的干细胞活性因子。
技术介绍
间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞表达、合成和分泌的转录因子、生长因子、细胞因子、调节肽、细胞信号分子、核苷类等生物活性因子，对心脏、肝脏、肾脏和神经系统等的修复与保护作用；并有促进细胞增殖、分化，防止细胞衰老；干细胞可通过其表达、合成和分泌的干细胞活性分子影响靶器官结构、功能状态及其病理状态下的修复，它是实现干细胞治疗改善靶器官功能、抗凋亡、抗癌、抗衰老、抗炎、治疗糖尿病等作用的重要功能物质。本专利技术提供了间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞表达、合成和分泌的干细胞活性因子的分离与制备方法。分离制备的干细胞活性因子在再生医学(包括恶性肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有广阔的应用前景，并将产生重大的社会效益和巨大的经济效益。
技术实现思路
分离制备的间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性物质可分为两类:小分子干细胞活性物质成为干细胞活性转移因子。大分子物质为大分子干细胞活性因子。 (一 )分离培养干细胞1、收获干细胞培养的上清液:分离培养干细胞，用相应的培养基和因子培养细胞，待细胞生长到合适阶段，收获上清液；亦可多次传代，多次收获。2、收获培养的干细胞:分离培养干细胞，用相应的培养基和因子培养细胞，待细胞生长到合适阶段，收获培养的干细胞。(二)干细胞活性因子的分离制备1、裂解细胞、释放干细胞活性因子将收获的干细胞加合适的液体，并调节到合适的PH值，采用机械(超声波、胶体磨等)或物理(如多次冻融等)学方法裂解破坏细胞，使其释放细胞内干细胞活性因子。干细胞培养上清液不需裂解程序，可直接按下面方法分离提取干细胞活性因子。2、分离提取干细胞活性因子可用以下方法:(I)透析提取小分子干细胞活性因子(相似于干细胞活性转移因子)将上述干细胞裂解物，经适当处理后，装入透析袋或玻璃纸透析装置内，在一定温度下透析，12-30小时收取透析液。(2)中空纤维柱分离提取干细胞活性因子将上述干细胞裂解物，经适当处理后，用适当分子截留孔径(如0.2KD、5KD、10KD、15KD等)的中空纤维柱分离截取干细胞活性因子，按分子量不同，小分子物质为干细胞活性转移因子，大分子物质为大分子干细胞活性因子。(3)离子交换和层析提取干细胞活性因子采用离子交换和层析分离提取干细胞活性因子，根据干细胞的分子量或亲和性分步(或特定)收集干细胞活性因子。3、干细胞活性因子的鉴定(I)蛋白质浓度的鉴定。(2)核糖和多核苷酸的浓度鉴定。(3)蛋白质和 核酸类物质的分类鉴定。(4)干细胞活性因子的生物活性鉴定。4、可形成的干细胞活性因子制剂(I)注射用制剂。(2) 口服制剂。(3)喷雾制剂。(4)外用制剂。附图说明无具体实施例方式下面通过四个实例描述本专利技术所涉及的提取干细胞活性因子的方法，但本专利技术所涉及的范围并不局限于本四个实例。实施例一:用透析袋或玻璃纸制备干细胞小分子活性因子(类似转移因子)1、细胞分离:从胎儿骨髓、肝、脾、脐带；婴儿脐带；人骨髓、外周血液；人脂肪组织等分离干细胞、间充质干细胞和成体干细胞，用专门配制的或购买的培养基培养细胞干细胞。2、细胞检定:经流式细胞仪检定细胞表面标志和生物芯片检定其表面标志、生长因子和细胞因子等。3、细胞和细胞分泌液的收获:(I)收获细胞分泌液:直接收获细胞培养上清液,然后进行分离纯化。(2)收获干细胞:将培养一定时间的干细胞，2000转/分，离心10分钟，上清液为细胞分泌液；细胞用注射用水悬浮，调整细胞浓度，用醋酸缓冲液调PH3.5-7.0。(3)破碎细胞:将悬浮的细胞置于_20°C冷冻，水浴解冻，连续冻容3次，显微镜下观察细胞冻容情况，如还有较多的完整细胞，可增加冻融次数。(4)收获冻融液:将细胞冻融液4000转/分，离心15分，取上清液(细胞冻融液)用NaOH溶液调ρΗ7.0。(5)透析:将细胞冻融液装入分子截留量为I万(10KD) 1.5万的透析袋和玻璃纸装置内，对PBS透析8 30小时，温度为4°C左右。中间每3小时将透析袋或玻璃纸装置内的液体物质混匀一次。取出透析袋或玻璃纸装置，透析袋内和玻璃纸装置内的液体，用于进一步分离大分子干细胞活性因子。(6)超滤:收集浓缩透析液，将透析液用0.15KD孔径的中空纤维过柱，截留0.2KD以上的小分子干细胞因子，去水并将小分子干细胞因子浓缩。用注射用生理盐水调小分子干细胞至所需浓度。(7)必要时冻干。实施例二:用中空纤维分离获取干细胞活性因子1、干细胞破碎(冻融)液、透析袋和玻璃纸装置内液体和细胞培养上清液(细胞分泌液)过一定孔径的中空纤维柱。2、分离获取大分子干细胞因子:(I)分离截取干细胞因子:用10 15KD孔径的中空纤维，将上述液体物质过柱；截取10 15KD以上的干细胞因子，再过150KD孔径的中空纤维柱，收集15 150KD的干细胞因子。 (2)收集浓缩干细胞因子:将收集的15 150KD的干细胞因子，用0.15KD孔径的中空纤维过柱浓缩去掉水分子。3、分离截取小分子干细胞因子(类似转移因子)(I)分离截取浓缩小分子干细胞因子:将10 15KD以下的干细胞因子，用0.15KD孔径的中空纤维过柱，去水并浓缩小分子干细胞因子。(2)收集小分子干细胞因子:将浓缩去水的小分子干细胞因子用生理盐水调至所需浓度4、必要时冻干干细胞因子。实施例三:层析分离(离子层析、疏水层析、亲和层析、凝胶层析等)本例以凝胶层析分离单分子或多分子物质1、根据干细胞分子量大小用一定型号的葡聚糖凝胶(Sephndex)柱进行分离纯化。2、干细胞破碎(冻融)液、透析袋和玻璃纸装置内液体和细胞培养上清液过柱。3、按分子量大小分布收集流出液。4、用0.15KD的中空纤维浓缩去水。5、调制所需浓度。6、必要时冻干。实施例四:分离提取干细胞，可以多种方法联用，如层析(凝胶层析加亲和层析)、中空纤维及透析联用。提取干细胞因子环境条件的基本要求:(I)细胞:包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞。(2)场地:合乎GMP要求的车间。(3)制品用水及化学药品:注射用水、注射用胜利盐水、化学物质要求分析纯。干细胞活性因子的鉴定:(I)蛋白质浓度的鉴定。(2)核糖和多核苷酸的浓度鉴定。(3)蛋白质和核酸类物质的分类鉴定。(4)干细胞 活性因子的生物活性鉴定。权利要求1.用透析袋或玻璃纸提取小分子间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性物质(干细胞活性转移因子)。2.用中空纤维柱分离截留小分子间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性物质和大分子干细胞活性物质。3.用层析法分离提取制备间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞内的干细胞活性因子。4.裂解破坏干细胞，分离提取制备间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性因子。全文摘要本专利技术设计。通过干细胞培养的上清液和培养的干细胞，将其细胞破碎，提取干细胞中的干细胞活性因子。分离制备的干细胞活性因子在再生医学(包括恶性肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等)和保健品等中具有广阔的应用前景，并将产生重大的社会效益和巨大的经济效益。文档编号A61K35/407GK10本文档来自技高网...
【技术保护点】
用透析袋或玻璃纸提取小分子间充质干细胞、神经干细胞和诱导干细胞活性物质(干细胞活性转移因子)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯长访，罗军蓉，
申请(专利权)人：冯长访，罗军蓉，
类型：发明
国别省市：
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