Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，属于诱导干细胞替代缺损的神经元细胞治疗帕金森氏病的方法。本发明专利技术步骤有构建Lmx1a基因克隆及重组质粒，构建与包装重组腺病毒Ad-Lmx1a，将感染Ad-Lmx1a的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元；以及rASCs和NSCs传代细胞的培养等。本发明专利技术诱导的神经元样细胞能分化出表达多巴胺能神经元细胞蛋白标志物，且诱导后的细胞可传导电信号或分泌神经递质，证明诱导细胞为神经元细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子细胞生物学，特别是诱导干细胞替代缺损的神经元细胞以治疗帕金森氏病的方法。
技术介绍
帕金森氏病(Parkinson，s disease, PD)是一种中老年常见的慢性神经系统退行性变性疾病，主要病理特征是黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的选择性变性丢失和残存于神经元内含大量a-突触核蛋白(a-synuclein)、synphilin_l和Parkin等成分的路易小体(Lewy bodies)形成对于帕金森氏病。临床治疗多以药物治疗为主，不能从根本上去除病因，也不能延缓疾病的进程，而且随着长期用药和疾病的发展，效果进行性下降，副作用日趋严重。在脑血管病人增加、与环境污染导致的重金属和化学物质接触以及生活压力等多重因素影响下，帕金森病呈增长趋势，出现年轻化，患者和社会的负担越来越重。细胞替代治疗是重建受损神经系统的组织结构，恢复神经系统功能的一种有效策略。按照传统观念，成年哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system, CNS)属于完全有丝分裂后的组织，不具有自我更新和修复的能力。因此，研究者把重建神经系统功能的重点放在胚胎组织的移植上，利用胚胎脑组织移植治疗神经系统疾病动物模型和患者，在实验和临床研究中取得了成功的经验。但移植胚胎组织存在形成畸胎瘤的风险和伦理道德要求，限制了移植治疗的广泛应用。因此，较为理想的方法就是找到能产生多巴胺的细胞或能分化成多巴胺能神经元的干细胞，从根本上解决多巴胺能神经元细胞的来源。研究早期，研究人员将胚胎干细胞直接移植到帕金森病小鼠模型体内，胚胎干细胞可以部分分化为TH阳性的神经元，但把小剂量的胚胎干细胞移植到帕金森病小鼠模型黑质核团，数周后约 20%的小鼠的大脑内出现畸胎瘤。细胞替代疗法尤其是帕金森氏病的细胞治疗要解决的关键问题是选择合适的替代细胞。间充质干细胞由于具有组织修复特性、自我更新及增殖分化、取材简单、资源丰富等特点而成为了 ro细胞替代治疗的理想候选细胞。目前，尽管中胚层间充质干细胞向DA能神经元定向分化尚无十分高效的诱导方法，但却受到研究人员重视，其分子机制逐渐被揭示和认识。在胞外发育信号的诱导下，月旨肪来源的间充质干细胞(Rhesus adipose stem cells,rASCs)能够向其他的细胞系诱导分化，但其分化分子机制却知之甚少。研究表明，Lmxla是多巴胺能神经元发育过程中的关键调控因子，能够启动神经元细胞的发育程序，使小鼠胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元。但是，多巴胺能神经元的分化是多因素、多步骤诱导的复杂过程，需要细胞内部和外部多条信号通路在不同时间协调作用，激活多种转录因子，引起细胞广泛的基因表达谱的变化。神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)是存在于中枢神经系统中具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。除了在体内能分化为神经元、星形胶质细胞核少突胶质细胞外，还能够分泌大量的营养因子，如⑶NF、Neuturin等,对神经元细胞进行营养保护。
技术实现思路
本专利技术的目的是以恒河猴为研究对象，提供一种采集恒河猴的脂肪间充质干细胞进行体外培养，进而在Lmxla介导下与神经干细胞共培养将rASCs转分化为DA能神经元的方法。本专利技术Lmxla介导的与NSCs共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤: 步骤(I):构建Lmxla基因克隆及重组质粒 以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)为模板，引物为:Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3', 通过PCR扩增获得带Sal I和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttIe-CMV中，通过SalI和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla，测序并与理论结果一致; 步骤(2):构建与包装重组腺病毒Ad-Lmxla 将步骤(I)重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI线形化和CIAP进行5'去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组PAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒,筛选阳性克隆,与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段； 筛选出的pAdEasy-1重组质粒经鉴定后转化XL_10 (Gold)，扩增、提取质粒,使质粒浓度达到0.1 ii g/ ii L，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒重组腺病毒Ad-Lmxla，10天后细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒； 步骤(3):将感染Ad-Lmxla的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元Ca)诱导前,取rASCs第二代细胞,接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM ;培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2%B27 的 Neural Basal 培养液。(b)以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs，并将培养液更换为含2% B27的NeuralBasal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集； (c)将接种有NSCs的transwell小室放入接种有(b)的产物细胞的六孔板中，NSCs与(b)的产物细胞在含2% B27的Neural Basal培养液中共培养24h，细胞数目明显增多，3天后将诱导液换液为Neural Basal正式诱导液II，每隔3天换一次诱导液II，直至21天；以上DMEM/F12诱导液I由以下成分组成:2%FBS,1.7 m SHH,20 ng/mLbFGF, 6 mM 3 -巯基乙醇，DMEM/F12培养基。以上Neural Basal正式诱导液II由以下成分组成:2%B27,1.7 m SHH,100 ng/mLFGF-8,20 ng/mLbFGF,1% N2 supplement,20 m & -NADP, Neural Basal 培养基。所述的方法是步骤(3)中rASCs第二代细胞的培养: Ca)氯胺酮麻醉恒河猴，无菌条件下取6kg成年恒河猴大网膜脂肪组织f2g。PBS中洗涤去除残存的血迹,分离血管和纤维成分，0.1%1型胶原酶，37°C消化Ih ； (b)消化完成后，加入与I型胶原酶等体积的含10%新生小牛犊血清的L-DMEM培养液终止消化，过滤，1500 r/min离心3 min,弃上清,吸取底部沉淀用于rASCs培养； (c)以1\106接种于1'-25培养瓶中，371:，5%0)2条件下细胞培养中培养4天，至单层贴壁细胞贴壁率接近90%时，0.25%胰蛋白酶消化，1:2传代，之后随细胞扩增至90%时，按1:2持续体外传代 培养。所述的方法是步骤(3)中NSCs的培养: 取孕14天的SD大鼠，在无菌条件下取出子宫置于预冷的Hanks缓冲液中，分离本文档来自技高网...
【技术保护点】
Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤：????步骤（1）：构建Lmx1a基因克隆及重组质粒????以Lmx1a?whole?transcript?cDNA（NM_138396）为模板，引物为：????P1?up：5′?GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG?3′，????P1?down：5′?CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG?3′，通过PCR扩增获得带SalI和EcoR?V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle?CMV中，通过SalI和EcoR?V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV?Lmx1a，测序并与理论结果一致；????步骤（2）：构建与包装重组腺病毒Ad?Lmx1a将步骤（1）重组穿梭质粒pShuttleCMV?Lmx1a先后用PmeI线形化和CIAP进行5′去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy?1同时电转感受态细胞BJ?5183，得同源pAdEasy?1重组质粒，筛选阳性克隆，与pAdEasy?1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段；筛选出的pAdEasy?1重组质粒经鉴定后转化XL?10(Gold),扩增、提取质粒，使质粒浓度达到0.1μg/μL，将质粒线性化后转染HEK?293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK?293细胞中包装重组腺病毒Ad?Lmx1a，10天后细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒；????步骤（3）：将感染Ad?Lmx1a的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元（a）诱导前，取rASCs第二代细胞，接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L?DMEM；培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2%?B27的Neural?Basal培养液;（b）以最佳MOI的Ad?Lmx1a感染rASCs，并将培养液更换为含2%?B27的Neural?Basal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集；以上DMEM/F12诱导液I由以下成分组成：2%FBS，1.7?μM?SHH，20?ng/mLbFGF，6?mM?β?巯基乙醇，DMEM/F12培养基;（c)将接种有NSCs的transwell小室放入接种有（b）的产物细胞的六孔板中，NSCs与（b）的产物细胞在含2%?B27的Neural?Basal培养液中共培养24h，细胞数目明显增多，3天后将诱导液换液为Neural?Basal正式诱导液II，每隔3天换一次诱导液II，直至21天；以上Neural?Basal正式诱导液II由以下成分组成：2%B27，1.7?μM?SHH,100?ng/mLFGF?8,20?ng/mLbFGF,?1%?N2?supplement，20?μM?β?NADP，Neural?Basal培养基。...
【技术特征摘要】
1.Lmxla介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤: 步骤(I):构建Lmxla基因克隆及重组质粒 以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)为模板，引物为:Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3', 通过PCR扩增获得带Sail和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle_CMV中，通过SalI和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla，测序并与理论结果一致; 步骤(2):构建与包装重组腺病毒Ad-Lmxla 将步骤(I)重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI线形化和CIAP进行5'去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组PAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒,筛选阳性克隆,与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段； 筛选出的pAdEasy-1重组质粒经鉴定后转化XL_10 (Gold)，扩增、提取质粒,使质粒浓度达到0.1 ii g/ ii L，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒Ad-Lmxla，10天后细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒； 步骤(3):将感染Ad-Lmxla的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元Ca)诱导前,取rASCs第二代细胞,接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM ;培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2%B27 的 Neural Basal 培养液; (b)以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs，并将培养液更换为含2%B27的Neural Basal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集； 以上DMEM/F1...
【专利技术属性】
技术研发人员：周艳，李鸿钧，孙茂盛，严敏，吴晋元，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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