一种新的诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途技术

本发明专利技术提供了一种新的诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途。本发明专利技术涉及中内胚层分化发育相关因子作为诱导因子用于诱导多潜能干细胞产生的用途。本发明专利技术通过向分化的细胞提供诱导因子从而诱导产生诱导多潜能干细胞(iPS细胞)，所述诱导因子包含中内胚层分化发育相关因子、Sox2、Klf4和任选地c-Myc。在本发明专利技术中，通过中内胚层分化发育相关因子替代Oct4产生的iPS细胞具有和鼠胚胎干细胞相似的特性，即具有维持自我更新的能力以及分化的全能性。

【技术实现步骤摘要】
一种新的诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途
本专利技术涉及一种诱导体细胞重编程的方法，试剂盒及用途。
技术介绍
(一)胚胎干细胞简介胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESCs，简称ES细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。(二)干细胞多能性(pluripotency)的特点：胚胎干细胞因为具有向三个胚层细胞的分化能力而被称为“多潜能”干细胞，此外，胚胎瘤(EC)细胞和胚胎生殖(EG)细胞均具有和胚胎干细胞类似的多能性。多潜能干细胞共同的特点是：ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状(人胚胎干细胞较扁平，而小鼠胚胎干细胞较为隆起，细胞界限不明显)。具有AP酶活性，特异地表达SSEA4，TRA1-60，TRA1-81等表面标志(小鼠胚胎干细胞还特异性地表达SSEA1，而人胚胎干细胞不表达SSEA1)，及Oct4，Nanog，Sox2，rex1(ZFP42)，GDF3，lin28，mbd2，TEGF1等标志性基因。此外，还可以在悬浮培养条件下，形成胚胎小体(Embryonidbodies)结构，并发生自发分化，EB形成6-9天后贴壁培养，可检测到向内、中、外三个胚层分化的细胞。(三)胚胎干细胞的研究哺乳动物在正常情况下永远不会发生的事情是细胞的“去分化”——细胞倒转发育的进程，回归为一种更加原始的类型。事实上对于这条规则的唯一例外是肿瘤细胞，相比于其来源的组织细胞，它们的分化程度比较低。不幸的是，一些肿瘤细胞会无止境的分裂，显示了永生化的特点，而多能性细胞也具有相似的特点。直到最近，将一个正常成体细胞内的生物钟倒转的唯一办法是通过一种精细操作，让细胞回归成为胚胎样细胞的状态，这个过程被称为细胞的重编程。实现重编程的最古老的方法是体细胞的核移植技术，或者称为“克隆”，其具体操作是将一个正常成体细胞内的遗传物质通过显微注射进入卵细胞内，而卵细胞本身的DNA之前被去除掉。这种DNA与卵细胞形成的杂合体能够发育成为早期胚胎，从这种早期胚胎中可以提取多能性的干细胞。自从1997年多利羊的诞生和1998年首次分离得到人类胚胎干细胞以来，核移植技术作为一种可以量身定制获得多能性细胞的途径，进而能够移植替换疾病受损组织和创伤组织，受到了广泛的关注。卵细胞内的某些因子(我们了解得还很少)的确将成年供体细胞内的遗传物质变得年轻了，甚至包括端粒。端粒就像一顶帽子一样保护着染色体的末端，并随着年龄的增长逐渐变短，但重编程仍能让端粒保持年轻化的状态。尽管克隆技术在动物体内取得了长足的进展，但将之用于生成人类胚胎干细胞的努力仍然是不成功的。(四)诱导多能性干细胞(IPS细胞)的研究2006年8月，日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥(Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4，Sox2，c-Myc和KLF4)成功地将其诱导重编程成为全能性的干细胞，其性质和胚胎干细胞类似。(TakahashiandYamanaka，2006)从而首次揭示了通过转基因可以在分化的细胞中建立全能性。在该实验中，Yamanaka等人首先选取了和小鼠胚胎干细胞自我更新及维持多能性相关的24个基因，分别将他们克隆到逆转录病毒载体，对胚胎成纤维细胞进行共转染，在进行基于Fbx15报告体系的筛选之后，他们观察到了ES-like的细胞集落的形成。经过对这24个基因的进一步分析，他们发现，仅转导Oct4，Sox2，c-Myc，KLF4就可以使胚胎成纤维细胞完全转变成为诱导的多潜能干细胞(iPS细胞-InducedPluripotentStemCells，俗称“诱导的多潜能干细胞”)。该IPS细胞拥有正常的核型，表达类似胚胎干细胞的分子标志，可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的终末分化的细胞，能够在裸鼠体内形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有内、中、外三个胚层的分化细胞。此外，和胚胎干细胞一样，IPS细胞在Nanog和Oct4promoter上检测到H3的低甲基化和高乙酰化。然而，采用Fbx15基因作为reporter筛选出来的细胞并不具有完整的全能性，如：内源Oct4等干性基因仍然没有能够正常地启动表达，不能通过囊胚注射的方法制成嵌合小鼠等。同时，研究发现只用Oct4，Sox2和KLF4一样可以获得IPS细胞，cMyc并不是体细胞重编程所必需的转录因子。此后，采用Yamanaka的策略，一些新的用于产生诱导多能干细胞的因子被筛选出来。新加坡的Huck-HuiNg研究组发现Nr5a2和Klf4，Sox2，cMyc一起完成重编程(Jian-ChienDominicHengetal.，2009)，并且Oct4，Esrrb，Klf4，和cMyc一起也可以完成重编程。同时，研究发现只用Oct4并且在特殊的细胞类型，如神经干细胞(Kimetal.，2009)，滋养外胚层细胞(TongWuetal.，2011)等就可以实现将体细胞重编程为诱导多能干细胞。并且，在加上小分子的情况下还能实现将小鼠成纤维细胞转变为诱导多能干细胞(YanqinLietal.，2010)以及人的角质化细胞转变为诱导多能干细胞(SaiyongZhuetal.，2010)。迄今为止，不同研究组已经在许多种不同类型的细胞上尝试了重编程技术，并取得了成功。在诱导的方法学上也有了许多的改进。2008年，Hochedlinger课题组利用不整合基因组的腺病毒(Adenovirus)载体成功诱导了IPS细胞(MatthiasStadtfeldetal.，2008)；同年，Yamanaka利用质粒载体也成功诱导了IPS细胞(KeisukeOkitaetal.，2008)；piggyBac转座子体系后来也证实可以切除掉外源插入基因的方法完成重编程(WoltjenKetal.，2009)；后来DingSheng课题组利用四因子的蛋白也成功诱导IPS细胞(ZhouHetal.，2009)；最近，用RNA(LuigiWarrenetal.，2010)和小RNA(microRNA)也能实现成功的重编程(FrederickAnokye-Dansoetal.，2011andAlessandroRosaetal.，2011)。Gata3，Gata6，Gata4，Pax1，Six1，Gata2，Foxa2作为中内胚层分化基因已经被广泛报道，但其在重编程过程中的作用目前还没有报道。Gata3对于T细胞的特化具有重要调控作用(C.N.Tingetal.，1996)；Gata6和Gata4都是内胚层典型的marker，对于心肌细胞的特化有重要作用(J.K.Takeuchietal.，2009)；Pax1对于T细胞的成熟起关键作用(J.Wallinetal.，1996)；Six1对于小鼠的肾脏发育有重要作用(X.Lietal.，2003)；Gata2对于造血前体细胞的扩增是本文档来自技高网...

【技术保护点】
中内胚层分化发育相关因子作为诱导因子用于诱导多潜能干细胞产生的用途。

【技术特征摘要】
1.中内胚层分化发育相关因子作为诱导因子用于在OSKM或OSK重编程过程中通过替代Oct4来诱导多潜能干细胞产生的用途，其中所述中内胚层分化发育相关因子为选自GATA3,GATA6,GATA4,PAX1,GATA2,SIX1或FOXA2中的至少一个。2.一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞提供诱导因子的步骤，所述诱导因子包含在OSK重编程过程中的Sox2、Klf4和替代Oct4的中内胚层分化发育相关因子，其中所述分化的细胞来源于非人哺乳动物，其中所述中内胚层分化发育相关因子为选自GATA3,GATA6,GATA4,PAX1,GATA2,SIX1或FOXA2中的至少一个。3.权利要求2的方法，其中所述诱导因子还包含在OSKM重编程过程中的c-Myc。4.权利要求2或3的方法，其中所述分化的细胞是皮肤细胞，肝细胞，胃细胞，角质细胞或血液细胞。5.权利要求2或3的方法，其中所述细胞来自胚胎期，刚出生后或成体期。6.权利要求2或3的方法，其中所述分化的细胞来源于鼠或灵长类动物。7.一种制备诱导多潜能干细胞的方法，包括向分化的细胞提供诱导因子的步骤，所述诱导因子包含在OSK重编程过程中的Sox2、Klf4和替代Oct4的中内胚层分化发育相关因子，其中所述分化的细胞来源于人，其中所述细胞来自刚出生后或成体期，其中所述中内胚层分化发育相关因子为选自GATA3,GATA6,GATA4,PAX1,GATA2,SIX1或FOX...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓宏魁，赵扬，舒健，吴晨，吴业涛，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：