一种人单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于单个核细胞重编程的基质胶，它是羊膜间充质干细胞的裂解物。本发明专利技术还公开了一种将人单个核细胞诱导重编程为人诱导多能干细胞的方法。本发明专利技术基质胶的保存时间长，将人单个核细胞诱导重编程为人诱导多能干细胞的诱导率高，应用前景良好。

Method for reprogramming human mononuclear cells into induced pluripotent stem cells

The present invention discloses one kind of matrix adhesive for single nuclear cell reprogramming. The invention also discloses a method for reprogramming human mononuclear cells into human induced pluripotent stem cells. The invention has the advantages that the storage time of the matrix glue is long, and the reprogramming of human mononuclear cells can be induced by the induction of pluripotent stem cells, and the application prospect is good.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的方法。
技术介绍
人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)是一类全能性干细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化潜能。理论上无论是在体外还是体内环境，hESCs都能被诱导分化为人体几乎所有的细胞类型。hESCs的进一步研究和应用，将为移植疗法和治疗视网膜黄斑变性、帕金森、肌萎缩性侧索硬化症等疑难病症开辟新的途径。然而，由于hESCs难以获得且涉及敏感的伦理道德问题，使得hESCs的临床研究一度陷入尴尬境地而无法大规模开展。2007年，日本Yamanaka和美国Thomson实验室首次发表了用人体细胞重编程得到人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的方法。诱导多能干细胞成功地避开了人胚胎干细胞无法回避的伦理问题，而且具有与其相似的自我更新能力和向三个胚层分化的能力，有望成为无限获取人自体细胞的工具，用于基础生物学研究、疾病模型、药物筛选、基因矫正、细胞治疗等。而如何进一步安全、高效、低成本地进行重编程技术获得iPSCs细胞是本领域一直在不断努力达到的目标。2011年，Chou等人成功地运用Episomal质粒介导法将人脐带血单个核细胞重编程为ips细胞，该方法无病毒介导无基因整合，但是单个核细胞培养阶段引入了牛血清白蛋白(BSA)，重编程阶段涉及鼠源饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞，MEF)等，所以不是一种完全人源化的重编程方法。2015年，Chou等人又成功地运用Vitronectin基质胶替代MEF饲养层建立了全人源化的重编程方法，但是Vitronectin基质胶价格昂贵，配制后4℃保存不能超过一周，需现配现用。因此，需要进一步开发一种既安全(无病毒、无外源基因整合、全人源化)、高效，又成本相对低廉的重编程体系，对人iPSCs最终走向临床应用显得尤为迫切和需要。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新用于单个核细胞重编程的基质胶以及将人单个核细胞诱导重编程为人诱导多能干细胞的方法以及人诱导多能干细胞的培养方法。本专利技术用于单个核细胞重编程的基质胶，它是羊膜间充质干细胞的裂解物。其中，所述基质胶按照如下方法制备：(1)取羊膜间充质干细胞，培养至汇合度超过90％时，裂解；(2)加入固定液固定，然后去除固定液，晾干，即可。步骤(1)中，裂解前后用PBS洗涤；和/或，裂解采用的裂解液是RIPA裂解液。其中，裂解液是浓度为1～10％(v/v)的RIPA裂解液，优选裂解液是浓度为5％(v/v)的RIPA裂解液；和/或裂解的时间为5-6min。步骤(1)中，所述羊膜间充质干细胞为人羊膜间充质干细胞。步骤(2)中，所述固定液是浓度为80％(v/v)的甲醇；和/或，固定的时间为10min。本专利技术将人单个核细胞诱导重编程为人诱导多能干细胞的方法，它是以前述的基质胶为诱导基质胶诱导的。所述方法的步骤如下：a、取人单个核细胞，采用红系培养基培养，转染Episomal质粒；所述红系培养基是以H3000培养基为基础培养基，添加了终浓度为100ng/ml的SCF、终浓度为10ng/ml的IL-3、终浓度为2U/ml的EPO、终浓度为40ng/ml的IGF-1、终浓度为1uM的Hydrocortisone；b、将转染后的细胞转入前述的基质胶中，加入培养基，诱导培养，即可。SCF：干细胞生长因子；IL-3：白细胞介素-3；EPO：促红细胞生成素；IGF-1：类胰岛素一号增长因子；Hydrocortisone：氢化可的松。步骤a中，所述人单个核细胞是脐带血单个核细胞或者外周血单个核细胞；采用红系培养基培养8～12天，步骤b中，诱导培养时，先添加红系培养基培养，第2天每孔补加红系培养基1ml，第3天每孔补加ReproTeSR培养基1ml，第7天更换ReproTeSR培养基，此后每天换液；所述红系培养基是以H3000培养基为基础培养基，添加了终浓度为100ng/ml的SCF、终浓度为10ng/ml的IL-3、终浓度为2U/ml的EPO、终浓度为40ng/ml的IGF-1、终浓度为1uM的Hydrocortisone；和/或，步骤b中，诱导培养的时间为14-20天。综上，本专利技术基质胶的保存时间长，将人单个核细胞诱导重编程为人诱导多能干细胞的诱导率高，应用前景良好。下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明，但是并不是对本专利技术的限制，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明图1为人羊膜间充质干细胞基质胶制备前后照片。A为制备前相差照片；B为用5％RIPA制备后相差照片。图2为ips细胞系在4℃保存不同时间的间充质干细胞基质胶上培养后的自发分化率统计。图3为人脐带血单个核细胞和人外周血单个核细胞红系培养扩增不同时间点细胞总数统计。图4为人脐带血单个核细胞和人外周血单个核细胞经红系培养扩增后流式细胞术分析。图5为人脐带血单个核细胞和人外周血单个核细胞经红系培养扩增后May-Grunwald Giemsa(MGG)染色。图6为本专利技术的实施流程图。图7为重编程过程中的ips样细胞形态。A为AM-MSCs基质胶上重编程DAY8相差照片；B为AM-MSCs基质胶上重编程DAY18相差照片；C为AM-MSCs基质胶上连续培养超过10代的iPSCs相差照片。图8为重编程效率统计。图9为PCR法检测外源基因整合情况。图10为Real-time PCR检测内源性基因表达图11为免疫荧光检测多能marker。图12为染色体核型分析。图13为畸胎瘤实验。具体实施方式实施例1本专利技术人羊膜间充质干细胞基质胶的制备1、试验方法1.1从分娩胎儿中无菌获取人羊膜组织，然后用PBS清洗3次。以无菌操作方式将组织机械剪成约0.2cm2大小，采用组织块贴壁法将组织块贴于Cellbind细胞培养板中，加入含1％双抗的TheraPEAKTM MSCGM-CDTM Medium，置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养。当细胞汇合度大于90％时，用0.05％胰酶消化，按1:4比例传代。1.2当传代培养P3至P10的人羊膜间充质干细胞(AM-MSCs)(图1A)生长至超过90％汇合时，用PBS洗1次，分别用1％RIPA裂解液、5％RIPA裂解液和10％RIPA裂解液室温裂解5-6min。然后再用PBS洗3次，加入80％甲醇室温固定10min。固定后弃固定液，室温晾干后密封，4℃保存备用。1.3分别取4℃保存7天、3个月的人羊膜间充质干细胞基质胶，以人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)基质胶为对照(用脐带间充质干细胞按照实施例1的方法制备的基质胶),将实验室已构建的人诱导多能干细胞ips细胞株机械法传代至基质胶上培养，培养基为life Technologies公司的Essential 8TM培养基，统计ips细胞在基质胶上的自发分化百分比(计算100个克隆中自发分化的克隆数)。2、实验结果显微镜下观察羊膜间充质干细胞(AM-MSCs)经过不同浓度的RIPA裂解前后的形态，结果显示1％RIPA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于人单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的基质胶，其特征在于：它是羊膜间充质干细胞的裂解物。

【技术特征摘要】
1.一种用于人单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的基质胶，其特征在于：它是羊膜间充质干细胞的裂解物。2.根据权利要求1所述的基质胶，其特征在于：所述基质胶按照如下方法制备：(1)取羊膜间充质干细胞，培养至汇合度大于90％时，裂解；(2)加入固定液固定，然后去除固定液，晾干，即可。3.根据权利要求2所述的基质胶，其特征在于：步骤(1)中，裂解前后用PBS洗涤；和/或，裂解采用的裂解液是RIPA裂解液。4.根据权利要求3所述的基质胶，其特征在于：裂解液是浓度为1～10％(v/v)的RIPA裂解液，优选裂解液是浓度为5～10％(v/v)的RIPA裂解液；和/或裂解的时间为5-6min。5.根据权利要求2所述的基质胶，其特征在于：步骤(1)中，所述羊膜间充质干细胞为人羊膜间充质干细胞。6.根据权利要求2所述的基质胶，其特征在于：步骤(2)中，所述固定液是浓度为80％(v/v)的甲醇；和/或，固定的时间为10min。7.一种将人单个核细胞诱导重编程为诱导多能干细胞的方法，其特征在于：它是以权利要求1～6任意一项所述的基质胶为基质胶诱导的。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤如下：a、取人单个核细...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹庆，伍明俊，马峰，陈强，
申请(专利权)人：四川新生命干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51