本发明专利技术提供了一种具有拆分消旋体γ‑内酰胺酶活性的(+)γ‑内酰胺酶及一种(+)γ‑内酰胺酶的编码基因，其基因来源于青枯假单胞杆菌，通过克隆表达的方法获得了编码基因并使用基因重组表达将(‑)γ‑内酰胺酶在重组大肠杆菌中进行表达。通过菌体拆分证明，此(‑)γ‑内酰胺酶具有绝对的对应选择性，用于拆分(±)γ‑内酰胺制备光学纯度大于99.8%的(‑)γ‑内酰胺，产率大于44%。
A (+) encoding gene and application of amidase activity in the gamma
The present invention provides a amidase activity separation of racemic gamma in (+) gamma lactam and a (+) encoding gene gamma lactam enzyme, the gene from Pseudomonas solanacearum, through cloning and expression of gene encoding gene and use the obtained weight group the expression () gamma lactamase expression in recombinant Escherichia coli. Through cell split, the () gamma lactam enzyme has a corresponding selective absolute, for resolution of (+) gamma lactam preparation optical purity greater than 99.8% () gamma lactam, yield more than 44%.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种具有(+)γ-内酰胺酶活性的编码基因和此基因编码的(+)γ-内酰胺酶的应用。
技术介绍
微生物的生物拆分是指利用酶或其他含活性酶的菌体选择性地与外消旋体的其中一个对映体优先反应将其转变成其它化合物，未反应的对映体与此化合物的物理化学性质存在差异，从而对外消旋体进行拆分分离。这种生物拆分具有严格的立体选择性，产物的对映体过量值(e.e.值)很高，适用各种药理试验和活性研究，同时，它的产物的分离提纯简单，副反应少；反应的温度、pH值、压力温和，生产安全性较高。生物拆分有利于较大规模的生产，目前已广泛应用于制备手性药物。A：(-)γ-内酰胺，B：(+)γ-内酰胺(1R,4S) (1R,4S)-2-氮杂二环 [2.2.1] 庚-5-烯-3-酮是制备碳环核苷类药物的重要手性中间体。目前的合成方法主要有化学法和生物法两种，其中化学法方法繁琐，且成本较高，而生物酶法具有高效，低能耗，低成本等一系列优点。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一种具有(+)γ-内酰胺酶活性的编码基因和此基因编码的(+)γ-内酰胺酶，该酶具有绝对的立体选择性，可用于(±)γ-内酰胺的拆分，从而制备(-)γ-内酰胺。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种具有拆分消旋体γ-内酰胺酶活性的(+)γ-内酰胺酶，所述的(+)γ-内酰胺酶是以下(a)或(b)的蛋白质，(a)一种包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)一种包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基通过缺失/或添加/或取代一个或至少一个氨基酸残基而获得的氨基酸残基序列，且具有(+)γ-内酰胺酶活性的由SEQ ID NO.1的氨基酸残基衍生的蛋白质。优选地，所述的(+)γ-内酰胺酶由499个氨基酸残基构成。优选地，所述的一种(+)γ-内酰胺酶的编码基因。优选地，所述的(+)γ-内酰胺酶的编码基因具有下述核苷酸序列(a)或(b)，(a)序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列；(b)编码序列表中SEQ ID NO.1蛋白质序列的多核苷酸。优选地，含有以上所述的编码基因的宿主菌。优选地，含有以上所述的编码基因的转基因细胞系。优选地，含有以上所述的编码基因的重组表达载体。优选地，一种利用(+)γ-内酰胺酶制备(-)γ-内酰胺的方法，包括如下步骤，将(+)γ-内酰胺加入至0.1moL/L，pH5.0- pH8.0磷酸盐缓冲液中，(+)γ-内酰胺为0.1 moL/L-0.2 moL/L，然后在此缓冲液中加入表达(+)γ-内酰胺酶的菌体或者细胞破碎后的酶液，加入的菌体量与缓冲液的质量体积比为20g-50g:1L，或加入同等菌体量破碎后的酶液，于30℃-60℃搅拌/振荡转化2-4小时，拆分得到(-)γ-内酰胺。本专利技术的有益效果体现在：提供了一种具有(-)γ-内酰胺酶活性的酶及其编码基因。此(-)γ-内酰胺酶具有绝对的对应选择性，用于拆分(±)γ-内酰胺制备光学纯度大于99.8%的(-)γ-内酰胺，产率大于44%。附图说明图1：本专利技术中消旋酯拆分图谱。具体实施方式以下结合实施例具体说明本专利技术的制备方法，如无特别说明，均为常规方法：本专利技术提供的(+)γ-内酰胺酶命名为PSlac，其来源于青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearumNCIB 40249)。以上所述的(+)γ-内酰胺酶PSlac是通过如下方法获得的：培养青枯假单胞杆菌并获得菌体细胞，提取菌体细胞的总DNA。将此总DNA为模板，以人工合成序列为上、下游引物进行PCR，并构件好蛋白基因表达载体，将构建好的表达载体导入宿主细胞，表达得到(+)γ-内酰胺酶PSlac。上游引物：TCCATGGGAATTAAGTTACCCACATTG 27所述上游引物中下划线为NcoⅠ酶切位点，下游引物：CCGAGCTCTCAAATACATTGAGCTAATTG 29所述下游引物中下划线为XhoⅠ酶切位点。本专利技术所述的(+)γ-内酰胺酶也可以通过化学合成的方法获得其编码基因，并通过常规的基因操作手段将化学合成后的基因构建对应的表达载体，并导入宿主细胞后正常表达，得到(+)γ-内酰胺酶。由于构建上述(+)γ-内酰胺酶PSlac编码基因的重组载体和宿主都可以为基因工程领域的质粒表达载体和其对应的宿主，可行的载体如pET系列载体，pUC系列载体，pQE系列载体等。可行的表达宿主如E.coil BL21(DE3)，TOP 10，DH5α等。表达后的蛋白也可进一步的利用公认已知的方法诱导表达。本专利技术所述的(+)γ-内酰胺酶PSlac可用于(±)γ-内酰胺的拆分，得到(-)γ-内酰胺，其具体方法为：将(±)γ-内酰胺加入至0.1moL/L，pH5.0- pH8.0磷酸盐缓冲液中，(±)γ-内酰胺为0.1 moL/L-0.2 moL/L，然后在此缓冲液中加入表达(+)γ-内酰胺酶的菌体或者细胞破碎后的酶液，加入的菌体量与缓冲液的质量体积比为20g-50g:1L，或加入同等菌体量破碎后的酶液，于30℃-60℃搅拌/振荡转化2-4小时，拆分得到(-)γ-内酰胺。γ-内酰胺酶PSlac编码基因的获得将冻干管保藏的青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearumNCIB 40249)安培管后端打碎并加入500µL的无菌生理盐水，随后将菌株的菌悬液接入灭菌好的液体营养肉汁培养基(牛肉提取物4g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L)中，180转/分钟，32℃培养24小时，12000转/分钟离心收集菌体。使用购自上海生工生物的细菌基因组提取试剂盒，按照操作步骤提取细菌的总DNA。以提取的DNA为模板，PCR扩增PSlac编码基因片段，反应体系50 µL：10×Taq Buffer5 µL2.5 mMdNTPs1.25 µL2 µM 上、下游引物等摩尔混合液2.5 µL模板DNA (200 ng/µL)1 µLTaq DNA 聚合酶 (5U/µL)0.5 µLddH2O39.75 µL。PCR扩增程序：94℃变性4 min，以94℃ 1 min，52℃ 45 s，72℃ 2 min反应30循环后，72℃延伸10 min。上游引物：TCCATGGGAATTAAGTTACCCACATTG 27所述上游引物中下划线为NcoⅠ酶切位点，下游引物：CCGAGCTCTCAAATACATTGAGCTAATTG 29所述下游引物中下划线为XhoⅠ酶切位点。 (+)γ-内酰胺酶PSlac的克隆与表达将扩增的编码基因使用产物纯化试剂盒(上海生工生物)纯化后，用T4 DNA连接酶与pGEM-T easy 载体连接，构建重组载体pGEM-PSlac，并转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上挑选白色菌落，进行菌落PCR验证。验证正确后，提取质粒pGEM-PSlac，使用和NcoⅠ-XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶回收酶切片段。在T4连接酶作用下16℃连接过夜，连接反应体系组成如下：pET28a vector (0.03 pmol)8 µL片段基因 (0.2 pmol)10 µL10×Ligation buffer3 µLdd本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有拆分消旋体γ‑内酰胺酶活性的(+)γ‑内酰胺酶，所述的(+)γ‑内酰胺酶是以下(a)或(b)的蛋白质，(a)一种包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)一种包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基通过缺失/或添加/或取代一个或至少一个氨基酸残基而获得的氨基酸残基序列，且具有(+)γ‑内酰胺酶活性的由SEQ ID NO.1的氨基酸残基衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺酶活性的(+)γ-内酰胺酶，所述的(+)γ-内酰胺酶是以下(a)或(b)的蛋白质，(a)一种包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)一种包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基通过缺失/或添加/或取代一个或至少一个氨基酸残基而获得的氨基酸残基序列，且具有(+)γ-内酰胺酶活性的由SEQ ID NO.1的氨基酸残基衍生的蛋白质。2.如权利要求1所述的一种(+)γ-内酰胺酶的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的(+)γ-内酰胺酶的编码基因具有下述核苷酸序列(a)或(b)，(a)序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列；(b)编码序列表中SEQ ID NO...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋亮，李岩，赵飞，余志强，黄忠林，
申请(专利权)人：苏州开元民生科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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