无外源诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法和应用技术

本发明专利技术公开一种无外源诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法，其中该方法包括以下步骤：1)在基质胶Matrigel或者Vitronectin的系统下培养人多能干细胞，直至达到60％-80％的密度；2)将步骤1得到的人多能干细胞用Dispase或EDTA消化，然后当日以神经诱导分化悬浮液培养，该日记为第0天；3)待可观察到人多能干细胞形成的细胞球时，加入神经诱导分化液继续培养；4)第7天进行贴壁操作；5)第10天加入SHH或者小分子化合物Purmophine进行持续诱导；6)第16天时将形成的类神经管结构吹下，并继续用神经诱导液培养；7)第22天即得所述GABA神经元。该方法可明显改善培养液繁复，分化效率不高以及排除外源因素的干扰。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种无外源性高效诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法及应用，属于生物医学

技术介绍
近年来，随着社会老龄化程度的加重，神经退行性疾病渐渐成为人们关注的焦点。由于人诱导多潜能干细胞技术的发展，以及动物实验取得的初步成效，应用该技术治疗中枢神经系统疾病展示出了广阔的前景。传统观点认为，成年哺乳动物神经元一旦受损就无法再生。这种观点使许多神经退行性疾病的治疗受到了极大的限制。虽然药物及手术取得了进展，但仍无法获得满意的疗效。目前，由于干细胞技术发展的日新月异，干细胞疗法治疗神经退行性疾病也日趋获得了人们的重视。细胞移植是修复和替代受损神经组织的有效方法，能够重建部分环路和功能，对神经系统疾病的治疗具有深远的意义。许多神经性障碍由于大脑内兴奋性神经元和抑制性神经元失衡所致异常放电导致。例如癫痫(Epilepsy)，精神分裂症(Schizophrenia)，自闭症(Autism)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等。大脑皮质中广泛存在着两种细胞，一种是兴奋型投射神经元，另一种是抑制型中间神经元。大量的研宄报道表明，大部分的神经性障碍及神经退行性疾病均与这两种神经元之间有关。在大脑皮质中，广泛存在着抑制型神经元γ-氨基丁酸神经元(GABA神经元)。GABA神经元起源于腹侧胎脑，内神经节隆起(Medial Gangl1nicEminences, MGE)。作为一种典型的抑制型神经元，GABA神经元多被认为与学习记忆功能息息相关。在生长发育的过程中，GABA神经元通过长距离的切线迀移至大脑皮质。细胞移植可通过模拟及重塑神经环路为癫痫，帕金森病，情感障碍和神经痛等疾病提供新的治疗方法。近年来，人多能干细胞定方向分化领域发展迅速，由于其具有的自我更新，高度繁殖和分化潜能等特征，人们已经可以在体外培养出多种干细胞，并将其诱导成所需的细胞类型。随着技术的进步和发展，已有文献报道可将人多能干细胞分化至多种前脑腹侧神经元。但现有的分化方法仍存在一些缺陷，包括培养液繁复，分化过程不能排除外源因素的干扰，分化效率不高等。以后若进一步应用细胞移植治疗神经推行性疾病，排除外源因素的干扰是首要条件之一。
技术实现思路
专利技术目的:本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种无外源诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法。具体涉及通过神经诱导培养液及Sonic Hedge (SHH)或其激动剂小分子化合物Purmophomine使人多潜能干细胞分化至前脑γ -氨基丁酸能(GABAergic)中间神经元的方法。该方法可明显改善培养液繁复，分化效率不高以及排除外源因素的干扰。技术方案:本专利技术所述的无外源性高效诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法，包括以下步骤:I)在基质胶Matrigel或者Vitronectin的系统下培养人多能干细胞，直至达到60% -80%的密度；2)将步骤I得到的人多能干细胞用Dispase或EDTA消化，然后当日以神经诱导分化悬浮液培养，该日记为第O天；3)待可观察到人多能干细胞形成的拟胚体球Embryoid body EB时，加入神经诱导分化液继续培养；4)第7天进行贴壁操作；5)第10天加入音猜因子SHH或者小分子化合物Purmophine进行持续诱导；6)第16天时将形成的类神经管结构吹下，并将吹下的类神经管结构用添加有SHH或Purmophine的神经诱导液持续诱导培养；7)第22天即得所述GABA神经元。进一步地，所述步骤2)中的神经诱导分化悬浮液为含有I %体积分数的N2培养基、0.1mMol/L非必须氨基酸的神经诱导分化液。进一步地，所述神经诱导分化悬浮液还包括0% — 50%体积分数的无饲养层人多能干细胞培液E8。进一步地，其特征在于，在所述步骤4)中，在贴壁前培养皿或培养板上提前铺人源性的基质胶Vitronectin以促进其贴壁。进一步地，所述步骤5)中加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2 μMol/L小分子化合物Purmophine的神经诱导液持续诱导6±1天。进一步地，所述步骤6)中重悬后，加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2 μ Mol/L小分子化合物Purmophine的神经诱导液持续诱导10±2天。进一步地，本专利技术还包括上述的诱导人多能干细胞分化为GABA神经元方法直接得到的为GABA神经元作为移植治疗神经退行性疾病药物的应用。本专利技术的人多能干细胞首先在在无饲养层的体系中进行培养，不同于传统方法使用的小鼠成纤维饲养层(MEF)，本方法中使用了基质胶Vitronectin或Matrigel作为基底培养人多能干细胞。然后通过添加神经诱导培养液及Sonic Hedge (SHH)或其激动剂小分子化合物Purmophomine使人多能干细胞分化至GABA神经元，整个过程均无异源因素的干扰。本专利技术与现有技术相比，其有益效果是:本专利技术的诱导分化方法是高效定向分化无饲养层的人多能干细胞至γ-氨基丁酸中间能神经元，现存的技术培养人多潜能干细胞依赖动物饲养层或分化效率较低。(Woodard, C.Μ.，et al.，iPSC-derived dopamineneurons reveal differences between monozygotic twins discordant for Parkinson’sdisease.Cell Rep, 2014.9(4):p.1173-82.)本专利技术的技术方案在诱导分化的第4周可以获得85.16±1.34%的γ-氨基丁酸中间能神经元。目前已发表文献中饲养层分化出GABA神经元的效率约为90%，本方法的分化效率与已发表文献中饲养层分化出的GABA神经元效率相似，但本方法优于现存技术在于无异源因素影响。(Liu, Y.，et al.，Directeddifferentiat1n of forebrain GABA interneurons from human pluripotent stemcells.Nat Protoc, 2013.8(9):p.1670-9.)此外，目前不依赖与动物饲养层的人多潜能干细胞的分化效率约为30%左右，本方法的分化效率远高于现存不依赖动物饲养层的人多潜能干细胞培养的分化效率。(Woodard, C.M.，et al.，iPSC-derived dopamine neuronsreveal differences between monozygotic twins discordant for Parkinson’sdisease.Cell Rep, 2014.9(4):p.1173-82.)且与现存技术相比较，本方法排除了动物源干扰，且用到的小分子化合物较少，而获得的GABA神经元的效率却明显高于现有技术的分化方法。且本方法操作简便，可重复性高。【附图说明】图1是无异源性人多能干细胞来源的GABA神经元，其中显示了诱导无饲养层人多能干细胞分化至GABA神经元的全过程。A图表示整个分化过程仅使用了神经诱导分化液，神经上皮细胞出现时加入SHH/Purmophine进行诱导分化最终获得高效率的GABA神经元，Bar 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无外源诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在基质胶Matrigel或者Vitronectin的系统下培养人多能干细胞，直至达到60％‑80％的密度；2)将步骤1得到的人多能干细胞用Dispase或EDTA消化，然后当日以神经诱导分化悬浮液培养，该日记为第0天；3)待可观察到人多能干细胞形成的拟胚体球Embryoid body EB时，加入神经诱导分化液继续培养；4)第7天进行贴壁操作；5)第10天加入音猬因子SHH或者小分子化合物Purmophine进行持续诱导；6)第16天时将形成的类神经管结构吹下，并将吹下的类神经管结构用添加有SHH或Purmophine的神经诱导液持续诱导培养；7)第22天即得所述GABA神经元。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘妍，朱东亚，袁方，方恺恒，徐敏，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32