一种四倍体萝卜的诱导方法技术

本发明专利技术提供一种四倍体萝卜的诱导方法，取若干二倍体萝卜种子进行清洗，将清洗后的种子置于质量浓度为0.2~1 %的秋水仙素水溶液中，于4~8℃下浸泡12~24 h；用水清洗浸泡后的种子，并放于浸湿的纱布、滤纸或河沙上，于25~30℃下恒温培养进行催芽处理；使幼苗生长至3~5cm长度后将幼苗移栽到田间或盆栽中进行种植；本发明专利技术通过对诱导植株苗期形态鉴定和气孔大小比较来鉴定四倍体植株，继续栽培四倍体植株得到四倍体萝卜。本发明专利技术方法操作简单，处理时间短，对萝卜进行诱导变异更彻底，出现的诱导嵌合体比两叶一心方法更少，植株成活率更好，诱导的成功率高，制得的四倍体胭脂萝卜色素含量和重量明显高于二倍体胭脂萝卜。

Method for inducing tetraploid radish

The present invention provides a method for inducing tetraploid radish, several diploid radish seeds were washed in the seed concentration after cleaning for colchicine solution 0.2~1%, at 4~8 deg.c for 12~24 h; clean water after soaking the seeds, and put them on the wetted filter paper or gauze, R. the sand, in 25~30 C were cultured and pregermination; the seedlings grew to 3~5cm in length after the seedlings into the field or pot planting; the induced seedling morphology and pore size compared to the identification of tetraploid cultivated tetraploid plants, to get tetraploid radish. The method of the invention has the advantages of simple operation, short processing time, the radish is mutated more thoroughly, chimeras induced less than two leaf method, the better the survival rate of plants, induced a high success rate, pigment content of tetraploid radish rouge and weight made two times higher than body rouge-radish.

【技术实现步骤摘要】
一种四倍体萝卜的诱导方法
本专利技术属于四倍体诱导
，具体涉及一种四倍体萝卜的诱导方法。
技术介绍
萝卜是十字花科（Brassicaceae）萝卜属（Raphanus）萝卜种（RaphanussativusL.）下的一个栽培品种，主产重庆市涪陵区及周边地区，是继榨菜之后的第二个涪陵特产。萝卜含有大量天然色素-萝卜红，是提取天然色素的理想原料。随着人们生活水平的提高，对天然色素的需求越来越大。但目前所种植的萝卜色素含量不高、产量低，种质资源混杂、退化现象严重，急需拓展萝卜种质资源。近年来利用化学试剂诱导四倍体，是创制新的萝卜种质资源的有效途径之一，目前，萝卜四倍体诱导的方法是利用秋水仙素和氟乐灵处理两叶一心的萝卜，再从形态和细胞学水平鉴定处理后的幼苗加倍是否成功，采用这种萝卜四倍体诱导技术主要存在以下问题：（1）药品耗量大，过程繁琐、耗时。两叶一心处理法，是在萝卜幼苗长至两叶一心时，在心叶上涂抹诱变剂，每颗幼苗需要连续处理3-7天，早、晚各处理一次，滴加的秋水仙素吸收不充分，容易蒸发、见光分解，处理的持续时间较长，且容易受到天气条件的影响，如果遇到连续阴雨天，将无法对叶片进行处理；（2）容易出现嵌合体。只处理心叶，由于分生组织细胞分裂的不同步性，用药剂处理后，有的细胞加倍为四倍体，有一部分细胞未加倍，从而形成嵌合体。由于二倍体细胞一般生长较快，而二倍体细胞较多时就会包埋了四倍体细胞而使倍性恢复。使植株成活率低，进而降低诱变率，已有方法诱导率在4.5%-16%，诱导率相对较低；（3）鉴定繁琐，需要从形态、细胞或分子水平进行鉴定，鉴定过程繁琐。基于此，现有的诱导方法存在一定不足之处，因此需要寻找一种简单、诱导率高且适合于萝卜的四倍体诱导方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术要解决的技术问题是：针对现有四倍体诱导存在药品耗量大、过程繁琐耗时、容易出现嵌合体、鉴定繁琐等不足之处，而提供一种处理时间短、操作便捷、变异更彻底、增加诱导成功率的四倍体萝卜的诱导方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种四倍体萝卜的诱导方法，采用秋水仙素水溶液对二倍体萝卜种子进行浸泡，对浸泡后的种子进行催芽处理得到幼苗，将幼苗移栽到田间或盆栽进行种植，得到四倍体萝卜。本专利技术通过创造性研究提出对还没有进行发芽的植物种子进行秋水仙素浸泡诱导，用秋水仙素抑制植物染色体的有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，染色体虽然纵裂，但是细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍，达到制备四倍体萝卜的目的。进一步，具体包括如下步骤：1）取若干二倍体萝卜种子进行清洗，将清洗后的种子置于质量浓度为0.2~1%的秋水仙素水溶液中，于4~8℃下浸泡12~24h；2）取出步骤1）清洗后的种子，用水清洗至少3次；3）将步骤2）清洗后的种子放于浸湿的纱布、滤纸或河沙上，于25~30℃下恒温培养进行催芽处理；4）步骤3）催芽处理使幼苗生长至3~5cm长度后，将幼苗移栽到田间或盆栽中进行种植，得到四倍体萝卜。本专利技术方法相较于现有技术两叶一心诱导方法而言处理时间短、操作简单，不需要连续进行诱导处理，且更为关键的是本专利技术诱导方法避免了现有两叶一心方法由于分生组织细胞分裂不同步，而造成的部分细胞加倍，部分细胞未加倍，从而形成嵌合体的技术问题，采用本专利技术秋水仙素对种子浸泡的方式对植物的变异更加彻底，出现诱导嵌合体的概率远远小于现有两叶一心诱导方法，增加了诱导的成功率，使植株的成活率更高，经检测采用本专利技术方法诱导得到的四倍体萝卜单株重量和内部红色素含量均比普通二倍体萝卜高，具有极高的应用价值。进一步，步骤4）幼苗移栽到田间或盆栽中种植后，在幼苗生长到6~8叶状态时，分别取二倍体萝卜植株和各诱导植株的无病虫害叶片放入冰中处理10~15min，将经过冰处理后的叶片放入混合固定液中固定15~20min，固定处理后取叶片的下表皮置于载玻片上，分别制得二倍体萝卜和各诱导植株的叶片观察片，用显微镜观察二倍体萝卜和各诱导植株的叶片中气孔并进行对比，将叶片中气孔少、气孔的横径和纵径大于二倍体萝卜叶片中气孔的横径和纵径的植株鉴定为四倍体诱导植株，继续栽培四倍体诱导植株，得到四倍体萝卜；其中，所述混合固定液为将体积浓度为38%~45%的甲醛水溶液、冰醋酸和体积浓度为70%~75%的乙醇水溶液按照1~1.5mL:0.5~1mL:16~18mL的体积比混合制得。采用本专利技术方法诱导得到的诱导植株，仅需要对叶片中的气孔数和气孔的横径、纵径进行观察即可以鉴定出四倍体萝卜，相较于现有技术中通过采用染色体数目鉴定的方式进行鉴定节省了时间，且在植物长叶未开花时期即可以辨别出四倍体萝卜的植株，该种鉴定方法的鉴定正确率高，在植株生长的早期即可进行鉴定，能及时反馈诱导结果。进一步，步骤4）幼苗移栽到田间或盆栽中进行种植至萝卜抽薹前，观察各诱导植株的根茎和叶片，以二倍体萝卜植株为对比，鉴定根茎粗、叶片卷曲皱缩、叶片厚度厚、叶片大和株高高的诱导植株为四倍体诱导植株，继续栽培四倍体诱导植株，得到四倍体萝卜。这样，可以仅通过观察诱导植株的生长形态即可以进行四倍体植株的鉴定，相较于从染色体层面观察才能鉴定四倍体植株而言，更加简单方便，费时少，当诱导植株多时，更方便进行鉴定和管理，鉴定过程没有对植株本身造成伤害，保证植株的完整性。再进一步，步骤4）对四倍体诱导植株继续栽培至开花后，以二倍体萝卜植株的花蕾为对比，对各四倍体诱导植株进行二次鉴定，鉴定花瓣大、花药大和花托大的四倍体诱导植株为确定诱导植株，继续栽培确定诱导植株，得到四倍体萝卜。进一步通过花瓣鉴定的方式对诱导植株进行进一步的鉴定，可以使诱导鉴定的结果更加准确，使获得四倍体萝卜的概率进一步提高，避免对非诱导成功植株进行栽培而浪费时间。作为又一优化，步骤4）幼苗移栽到田间或盆栽中种植至开花后，对花进行人工辅助授粉。采用人工辅助授粉的方式，能够显著提高种子结实率，保证种植得到的果实更多且质量更好。作为再一优化，所述萝卜为胭脂萝卜。本专利技术方法对胭脂萝卜取得了尤其好的诱导效果，取得了30.2%的高诱导率，明显高于现有采用两叶一心法进行诱导得到的诱导率4.5%-16%。本专利技术方案中，步骤4）幼苗移栽到田间或盆栽中种植至开花时，还可以分别取二倍体萝卜植株和各诱导植株的花蕾，制备二倍体萝卜植株和各诱导植株的花蕾染色体标本，采用显微镜观察二倍体萝卜植株和各诱导植株的花蕾染色体标本，将花蕾染色体数目为二倍体萝卜花蕾染色体数目两倍的诱导植株鉴定为四倍体诱导植株，继续栽培四倍体诱导植株，得到四倍体萝卜；采用这样观察染色体数目的方式进行鉴定，更加直观反映了染色体是否加倍成功。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术对四倍体萝卜进行诱导的方法操作简单，处理时间短，只需要采用秋水仙素水溶液浸泡种子即可，解决了现有两叶一心处理方法中连续诱导处理药品耗量大、过程繁琐耗时，容易出现嵌合体的问题。2、采用本专利技术方法对萝卜进行诱导变异更彻底，出现的诱导嵌合体比两叶一心方法更少，植株成活率更好，增加了诱导的成功率，本专利技术方法诱导率为30.2%，明显高于现有采用两叶一心法进行诱导得到的诱导率4.5%-16%，取得了意想不到的诱导效果。附图说明图1为诱导植株本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四倍体萝卜的诱导方法，其特征在于，采用秋水仙素水溶液对二倍体萝卜种子进行浸泡，对浸泡后的种子进行催芽处理得到幼苗，将幼苗移栽到田间或盆栽进行种植，得到四倍体萝卜。

【技术特征摘要】
1.一种四倍体萝卜的诱导方法，其特征在于，采用秋水仙素水溶液对二倍体萝卜种子进行浸泡，对浸泡后的种子进行催芽处理得到幼苗，将幼苗移栽到田间或盆栽进行种植，得到四倍体萝卜。2.根据权利要求1所述四倍体萝卜的诱导方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）取若干二倍体萝卜种子进行清洗，将清洗后的种子置于质量浓度为0.2~1%的秋水仙素水溶液中，于4~8℃下浸泡12~24h；2）取出步骤1）清洗后的种子，用水清洗至少3次；3）将步骤2）清洗后的种子放于浸湿的纱布、滤纸或河沙上，于25~30℃下恒温培养进行催芽处理；4）步骤3）催芽处理使幼苗生长至3~5cm长度后，将幼苗移栽到田间或盆栽中进行种植，得到四倍体萝卜。3.根据权利要求2所述四倍体萝卜的诱导方法，其特征在于，步骤4）幼苗移栽到田间或盆栽中种植后，在幼苗生长到6~8叶状态时，分别取二倍体萝卜植株和各诱导植株的无病虫害叶片放入冰中处理10~15min，将经过冰处理后的叶片放入混合固定液中固定15~20min，固定处理后取叶片的下表皮置于载玻片上，分别制得二倍体萝卜和各诱导植株的叶片观察片，用显微镜观察二倍体萝卜和各诱导植株的叶片中气孔数并进行对比，将叶片中气孔少、气...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈发波，吴照云，汪凤林，刘毅，湛静，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆,50