有关诱导感觉神经元的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了从如成纤维细胞之类的非神经元细胞产生诱导感觉神经元(iSN)的方法。本发明专利技术还提供了在多种治疗或非治疗性应用中使用iSN的方法，例如，以识别从非神经元细胞增强iSN形成的试剂或细胞调制的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本专利申请要求美国临时专利申请No.61/918965(2013年12月20日提交)的优先权。该优先权申请的全部公开内容通过引用以其整体并入本文并用于所有目的。专利技术背景背根神经节(DRG)和三叉神经的感觉神经元通过皮肤中的突起可以检测环境变化。这些神经元包括专用于伤害感受/痒感、机械感觉和本体感觉三大类。伤害感受是其中如热和触摸之类有害刺激引起皮肤的感觉神经元(伤害感受器)将信号发送到中枢神经系统的过程。痒感是痒的感觉。机械感觉是压力的检测，本体感觉是通过监测肌肉拉伸检测肌肉的运动。对影响各种类型的感觉神经元的痛、痒和疾病的控制一直是药物治疗的一大挑战。据报道，至少有11600万美国人和35％的世界人口患有慢性神经病或疼痛症(Elzahaf等人,Curr.Med.Res.Opin.28,1221-1229,2012)。然而，只有30％的处于慢性疼痛的患者响应“金标准”FDA批准的治疗(Finnerup等人,PA/N 150,573-581,2010)。实验室研究表现出响应于相同疼痛刺激的大范围的个体间差异。此外，日益认识到遗传因素是疼痛表型和对药物治疗的响应的主要贡献者。尽管这些发现，许多有关疼痛的药物发现一直依赖于动物模型，该动物模型在模拟人之间的细微差别方面是不太可能有用的并且与在体外筛选相比具有较低的吞吐量。这些因素可有助于解释针对即使有前途的临床前候选者的临床试验过程中惊人的高人员缩减率。对痒的控制和检测是理解不足的，并且也是显著未满足的医疗需要。虽然死后的人感觉神经元可用于研究，但这些细胞不能被遗传性改变，具有有限的可用性。本领域需要用于产生用于机理研究或药物筛选的足够数量的在体外的功能响应的感觉神经元的有效方法。本专利技术针对这一点以及在本领域中其他未满足的需求。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了用于产生诱导感觉神经元(iSN)的方法。该方法需要在非神经元细胞中共表达Brn3A/Ngnl(BN1)基因或Brn3A/Ngn2(BN2)基因的组合。通常，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神经元细胞中的表达是时序性的(temporal)。在一些方法中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神经元细胞中瞬时(transiently)表达。例如，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因可以通过诱导型表达系统(例如诱导型表达载体)在细胞中表达。在一些方法中，用于转化成感觉神经元的非神经元细胞是成纤维细胞、胚胎干细胞(ESC)，或诱导多能干细胞(iPSC)。在一些方法中，非神经元细胞是胚胎成纤维细胞或成体成纤维细胞。本专利技术的一些方法涉及从哺乳动物成纤维细胞(例如，来源于人、小鼠或大鼠的成纤维细胞)诱导感觉神经元的形成。在一些方法中，Brn3A基因和Ngnl基因在非神经元细胞中共表达。在其他一些方法中，Brn3A基因和Ngn2基因在非神经元细胞中共表达。在一些方法中，携带Brn3A基因和Ngnl或Ngn2基因的表达载体被引入非神经元细胞。例如，表达BN1或BN2基因的慢病毒载体可用于诱导非神经元细胞。本专利技术的一些方法还包括针对一种或多种神经元标记物的存在检测诱导感觉神经元。在一些相关的实施方式中，本专利技术提供了根据本文描述的方法产生的诱导感觉神经元。在其他一些实施方式中，本专利技术提供了携带表达Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的组合的一种或多种表达载体的分离的细胞。这些细胞中的一些是非神经元细胞。例如，该细胞可以是成纤维细胞、胚胎干细胞(ESC)，或诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，细胞是胚胎成纤维细胞或成体成纤维细胞。在一些优选的实施方式中，成纤维细胞来源于哺乳动物，例如，人、小鼠或大鼠。在一些细胞中，共表达Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的表达载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，表达载体是诱导型载体。在另一个方面，本专利技术提供了用于治疗受试者中与感觉神经元的损失或变性相关或由感觉神经元的损失或变性介导的神经系统疾病或病症的方法。该方法需要(1)从需要治疗的受试者获得非神经元细胞的群；(2)通过在非神经元细胞中共表达Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的组合从非神经元细胞产生诱导感觉神经元(iSN)的群；以及(3)将治疗有效量的iSN群施用给受试者。通常，所述非神经元细胞瞬时表达Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因。在一些方法中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神经元细胞中的表达是时序性的。在一些实施方式中，非神经元细胞是成纤维细胞、胚胎干细胞(ESCs)、或诱导多能干细胞(iPSC)。在一些优选的实施方式中，受试者是人，并且非神经元细胞是人成纤维细胞。在一些方法中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因通过慢病毒载体引入非神经元细胞。在另一个方面，本专利技术提供了用于识别刺激非神经元细胞转化成诱导的感觉神经元(iSN)的试剂或细胞调制的方法。这些方法需要(1)在候选化合物或细胞调制物的存在下，在非神经元细胞中共表达(1)Brn3A基因和(2)Ngnl或Ngn2基因，以及(2)检测相对于从未进行与特定候选化合物接触(或进行特定的细胞调制)的非神经元细胞iSN的转化，从已经进行与特定候选化合物接触(或进行特定的细胞调制)的非神经元细胞的iSN转化增强。该方法允许特定候选的化合物(或细胞调制)能识别为刺激非神经元细胞转化成诱导感觉神经元的试剂。通常，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神经元细胞中的表达是瞬时的。在一些优选的实施方式中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的表达是时序受控的(例如，经由使用诱导型表达载体)。在一些方法中，待筛选的候选化合物是转录因子或miRNA。一些其他方法涉及筛选细胞调制，如非神经元细胞的表观调制。在一些方法中，在筛选中使用的非神经元细胞是成纤维细胞、胚胎干细胞(ESC)，或诱导多能干细胞(iPSC)。例如，本专利技术的一些筛选方法使用胚胎成纤维细胞或成体成纤维细胞，例如来源于人、小鼠或大鼠的哺乳动物成纤维细胞。在一些优选的实施方式中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因通过慢病毒载体引入非神经元细胞。本专利技术的性质和优点的进一步理解可通过参考说明书和权利要求的剩余部分来实现。附图说明图1A-1H示出了稳定地重新编码成纤维细胞以获得功能上成熟的神经元的特性的两种发育相关的转录因子的瞬时共表达。(a)在成纤维细胞中持续8天的Brn3a与Ngnl或Ngn2的瞬时共表达诱导具有神经形态的细胞，针对泛神经标记物Map2和Tuj1细胞的染色在诱导后14天进行免疫染色。刻度条：100μm。(b)需要Brn3a与Ngnl或Ngn2的协同表达用于Map2/Tuj1双阳性细胞的诱导。TF被诱导持续8天并在诱导后14天进行免疫染色。条和误差代表平均值和来自三个重复实验的SEM。(c)BN2神经细胞中的突触表达，针对泛神经标记物Tuj1将细胞复染色。(d)在BN1神经细胞中的小泡相关膜蛋白(Vamp)表达。刻度条：25μm。(e本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生诱导感觉神经元(iSN)的方法，包括在非神经元细胞中共表达Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的组合，从而产生诱导感觉神经元。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 US 61/918,9651.一种用于产生诱导感觉神经元(iSN)的方法，包括在非神经元细胞中共表达Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的组合，从而产生诱导感觉神经元。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的表达是时序性的。3.如权利要求2所述的方法，其中，所述Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的时序表达是通过诱导型表达的。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述非神经元细胞是成纤维细胞、胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述非神经元细胞是胚胎成纤维细胞或成体成纤维细胞。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述成纤维细胞来源于哺乳动物。7.如权利要求6所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。8.如权利要求1所述的方法，其中，所述Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在所述非神经元细胞中是瞬时表达的。9.如权利要求1所述的方法，其中，所述Brn3A基因和所述Ngnl基因在所述非神经元细胞中共表达。10.如权利要求1所述的方法，其中，所述Brn3A基因和所述Ngn2基因在所述非神经元细胞中共表达。11.如权利要求1所述的方法，其中，携带所述Brn3A基因和所述Ngnl或Ngn2基因的表达载体被引入非神经元细胞。12.如权利要求11所述的方法，其中，所述表达载体是慢病毒载体。13.如权利要求1所述的方法，其还包括针对神经元标记物的存在检测诱导感觉神经元。14.一种根据权利要求1所述的方法产生的诱导感觉神经元。15.一种分离的细胞，其包含表达Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的组合的一种或多种表达载体。16.如权利要求15所述的细胞，其是非神经元细胞。17.如权利要求15所述的细胞，其是成纤维细胞、胚胎干细胞(ESC)、或诱导多能干细胞(iPSC)。18.如权利要求15所述的细胞，其是胚胎成纤维细胞或成体成纤维细胞。19.如权利要求18所述的细胞，其中，所述成纤维细胞来源于哺乳动物。20.如权利要求19所述的细胞，其中，所述哺乳动物是人、小鼠或大鼠。21.如权利要求15所述的细胞，其中，所述表达载体是慢病毒载体。22.如权利要求15所述的细胞，其中，所述表达载体是诱导型载体。23.一种用于治疗受试者中与感觉神经元的损失或变性相关或由感觉神经元的损失或变性介导的神经病症或疾病的方法，包括：(1)从需要治疗的受试者获得非...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔·W·布兰卡德，凯文·T·伊德，克莉丝汀·鲍尔温，
申请(专利权)人：斯克利普斯研究院，
类型：发明
国别省市：美国;US