一种人参不定根诱导增殖方法技术

本发明专利技术涉及一种人参不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸。利用本发明专利技术所提供的方法，可以显著提高诱导获得的不定根数量，而且，将诱导获得的不定根进行增殖培养后，与利用愈伤组织进行不定根诱导的方法相比不定根增殖率更高，增殖效果更好。

【技术实现步骤摘要】
一种人参不定根诱导增殖方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体的涉及一种人参不定根诱导增殖方法。
技术介绍
人参(PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科人参属多年生双子叶植物，为古老而名贵的中药材，具有调节人体免疫力、抗癌和抗糖尿病等多种作用。人参皂苷是其主要的活性物质。近年来，国内外对于人参的需求快速增长。但是，由于长期过度采挖，人参野生资源已基本枯竭，且人参栽培周期长，易受气候、病虫害及栽培条件的影响，难以满足越来越大的市场需求。人参组织培养技术周期短，不受季节限制，容易进行大规模的工业化生产，具有很大的发展前景。利用发根农杆菌诱导人参产生的发根生长迅速，皂苷种类与田间栽培的人参相同，含量比普通的细胞培养物高，且利用生物反应器大规模培养人参发根的体系也已建立[JeongGT,ParkDH,HwangB,etal.ComparisonofgrowthcharacteristicsofPanaxginsenghairyrootsinvariousbioreactors[J].ApplBiochemBiotechnol,2003,107:493]。然而，由于发根诱导过程中外源基因的导入具有潜在的安全性问题，因此该技术没有用于商业化。近年来，不经过发根农杆菌转化直接诱导人参不定根的研究取得了较大进展。但不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的[SivakumarG,YuKW,PaekKY.ProductionofbiomassandginsenosidesfromadventitiousrootsofPanaxginsenginbioreactorcultures[J].EngLifeSci,2005,4:333]。上述方法的缺陷在于：需要先诱导愈伤组织，导致实验周期长。因此，有必要提供一种简便的直接利用人参组培苗作为外植体的不定根诱导增殖方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用人参组培苗的根、茎段或叶片诱导不定根产生及对不定根进行增殖培养的方法。为达到以上目的，本专利技术提供了一种不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸(IBA)。优选的为了获得更好的人参不定根诱导增殖效果，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为2-5mg/L的吲哚丁酸。可选的，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基还含有浓度为1.8-2.2质量％的蔗糖。可选的，所述诱导增殖方法包括以下步骤：1)将人参组培苗切割成组织小块，利用固体诱导培养基在培养温度为23-25℃的黑暗条件下诱导培养3-6周获得不定根；2)将步骤1)获得的不定根切割成不定根小块，利用液体增殖培养基在培养温度为23-25℃的黑暗条件下以50-80rpm的速度震荡培养3-9周。可选的，所述组织小块为对人参组培苗根进行切割获得的人参组培苗根小块、对人参组培苗茎段进行切割获得的人参组培苗茎小块或对人参组培苗叶片进行切割获得的人参组培苗叶小块。可选的，所述人参组培苗为经种子萌发或者外植体离体培养获得的组培苗，组培苗的日龄为28-32天。可选的，所述人参组培苗的品种为石柱参或大马牙参。利用本专利技术所提供的方法，可以显著提高诱导获得的不定根数量，而且，将诱导获得的不定根进行增殖培养后，与利用愈伤组织进行不定根诱导的方法相比不定根增殖率更高，增殖效果更好。此外本专利技术所提供的方法可以大大缩短获得人参不定根的时间，通过直接对人参组培苗进行不定根诱导增殖避免了将组培苗培养成完整植株后取得外植体进行愈伤组织诱导培养的步骤，缩短了实验周期。为利用人参不定根生产人参皂苷奠定了良好的基础，也为利用人参不定根进行代谢途径的基础研究提供了重要的材料。附图说明图1为人参组培苗不同组织诱导增殖产生的不定根；图中，(A)为利用人参组培苗根诱导培养不定根的情况；(B)为利用人参组培苗茎段诱导培养不定根的情况；(C)为利用人参组培苗叶片诱导培养不定根的情况。图2为人参组培苗不同组织诱导产生不定根的增殖情况；图中，(A)为组培苗根；(B)为组培苗茎段；(C)为组培苗叶片；1/2MS(-N)+5mg/LIBA和1/2MS(-N)+2mg/LIBA代表培养基类型；1st代表第一次继代，2nd代表第二次继代，3rd代表第三次继代。图3为五年生人参的根愈伤组织诱导产生不定根的增殖培养；1/2MS(-N)+5mg/LIBA和1/2MS(-N)+2mg/LIBA代表培养基类型；1st代表第一次继代，2nd代表第二次继代，3rd代表第三次继代。具体实施方式下面将通过具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术提供了一种人参不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸。在本专利技术所提供的方法中，为了提高诱导和增殖的效果，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为2-5mg/L的吲哚丁酸。在本专利技术中，所述人参组培苗为经种子萌发得到的组培苗或者经过外植体离体培养获得的再生植株组培苗。优选的情况下，当利用本专利技术提供的方法对经过离体培养获得的人参组培苗进行诱导增殖时，能够获得优异的不定根诱导增殖效果。其中，本专利技术所提供的方法对于经种子萌发得到的组培苗的获得方法没有特别的限制，可以是按照本领域常规的处理方法获得的，例如，在本专利技术的一种实施方式中，经种子萌发得到组培苗的方法可以为：取经层积处理后的人参裂口种子，剥去外壳，经70％乙醇浸泡1分钟后，于1％次氯酸钠中消毒20分钟，无菌水清洗3-4次后，于超净台剥出完整胚，接种于1/2MS培养基，在24±2℃黑暗培养3天后，转入光下培养4周后即可用于不定根的诱导。其中，本专利技术所提供的方法对于通过外植体离体培养体系获得再生植株组培苗的方法没有特别的限制，可以是按照本领域常规的处理方法获得的，例如，在本专利技术的一种实施方式中，通过外植体离体培养体系获得再生植株组培苗的方法可以为：将人参种子去壳后，用70％乙醇表面消毒1分钟后，转入1％次氯酸钠溶液消毒20分钟，无菌水清洗3-4次，然后在超净工作台用无菌解剖刀小心取出胚，接种至1/2MS培养基(含2％蔗糖和7g/L琼脂，pH值为5.8)于24±2℃黑暗培养3天后，切下子叶接入MS+1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸的培养基(含3％蔗糖和7g/L琼脂，pH值为5.8)，于24±2℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养。取生长状态良好的胚性愈伤组织转入不含激素的MS培养基(含5％蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8)进行体细胞胚的诱导。约一个月后，将诱导出的体细胞胚转入含5mg/L赤霉素的1/2MS培养基(含2％蔗糖和2.5g/L植物凝胶，pH值为5.8)进行植株的萌发，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人参不定根诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(‑N)培养基为基本培养基含有浓度为1‑10mg/L的吲哚丁酸。

【技术特征摘要】
1.一种人参不定根诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将人参组培苗切割成组织小块，利用固体诱导培养基在培养温度为23-25℃的黑暗条件下诱导培养3-6周获得不定根；2)将步骤1)获得的不定根切割成不定根小块，利用液体增殖培养基在培养温度为23-25℃的黑暗条件下以50-80rpm的速度震荡培养3-9周，进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸以及浓度为1.8-2.2质量％的蔗糖；其中，1/2MS(-N)培养基为大量元素减半其他成分不变的MS(-N)培养基，其中，MS(-N)培养基是不含有硝酸铵的MS培养基；...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢善发，王梅珍，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11