三叶青不定根的诱导及繁殖方法技术

本发明专利技术公开了三叶青不定根的诱导及繁殖方法，按如下步骤进行：（1）愈伤组织的诱导：将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净，在超净工作台上用乙醇消毒后转入升汞消毒，然后用无菌水冲洗，后切割，正面朝上平放于诱导培养基上，27±1 ℃黑暗培养。（2）愈伤组织的增殖：将步骤（1）获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于增殖培养基上，27±1 ℃黑暗培养。（3）愈伤组织分化不定根的诱导：将步骤（2）获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于不定根诱导培养基上，27±1 ℃黑暗培养。（4）不定根的繁殖：将步骤（3）获得的不定根在超净工作台上切割成设定的长度，接种于不定根增殖的液体培养基中，黑暗培养后转入光照培养。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种三叶青不定根的诱导及繁殖方法。
技术介绍
三叶崖爬藤(TetrastlgmahemsleyanumDielsetGilg)是中国特有的珍稀药用植物，主要以块根入药，性凉、无毒、味甘微苦，在小儿高热、扁桃体炎、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性脑膜炎等方面疗效显著，还在类风湿性关节炎、妇科疾病血崩、白带、血液病、心脑血管疾病、毒蛇咬伤、痈疽、肛裂及抗艾滋病毒和抗肿瘤等临床治疗方面有很好的疗效，有“植物青霉素”之称。已研究发现三叶青的黄酮提取物对H-22、SMMC-7721和HepG2肝癌细胞、A549肺癌细胞、SGC一7901人胃癌细胞、结肠癌细胞系RKO细胞和HT-29细胞、艾氏瘤、S180肉瘤瘤株、白血病细胞株系HL60、K562、人恶性黑色素瘤A375细胞、人宫颈癌Hela229细胞、人胃腺癌AGS细胞、人膀胱癌5637细胞均有一定的抑制或促凋亡作用，具有保肝护肝、抗病毒、消炎镇痛解热等药理作用，对关节炎、痛经也有一定的治疗作用。三叶青因其药理研究发现和显著的临床疗效，医学需求在持续增强，但由于人为过度采掘，导致现有野生资源已处于濒危状态，被列为浙江省濒危植物目录。因此，对三叶青资源的保护和可持续利用刻不容缓。目前，三叶青的驯化栽培、离体扦插及组培快繁技术问题都已基本解决，但其人工栽培中药用部位葫芦块根块根生产技术存在严重的瓶颈制约。因此，为切实保护三叶青有限的野生资源和人工栽培资源，解决市场供需矛盾，利用生物技术手段来生产三叶青药用功能成分的研究显得尤为迫切。而不定根培养技术作为新发展起来的技术具有次生代谢物产量稳定、快速而成为根用类药用植物生产次生代谢物的主要途径。
技术实现思路
本专利技术公开了一种三叶青不定根的诱导及繁殖方法，其能获得高生物量和黄酮含量的不定根，且可以周年生产，不受季节和气候因素的限制。本专利技术通过对三叶青叶片诱导的愈伤组织进行不定根的诱导、增殖、高效培养生产组培次生代谢物黄酮类化合物的关键技术研究，形成三叶青组培不定根培养黄酮类化合物的技术方案，为今后工业化生产三叶青中抗肿瘤功能物质黄酮类化合物打好基础，以期为后续开发抗肿瘤药物生产解决原料需求问题。为达到上述目的，本专利技术采取以下技术方案：三叶青不定根的诱导及繁殖方法，其按如下步骤进行：(1)愈伤组织的诱导：将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净，在超净工作台上用乙醇消毒后转入升汞消毒，然后用无菌水冲洗数次(如5～6次)，切割后正面朝上平放于诱导培养基上，27±1℃黑暗培养数天(如30d)；(2)愈伤组织的增殖：将步骤(1)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于增殖培养基上，27±1℃黑暗培养数天(如30d)；(3)愈伤组织分化不定根的诱导：将步骤(2)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于不定根诱导培养基上，27±1℃黑暗培养数天(如30d)；(4)不定根的繁殖：将步骤(3)获得的不定根在超净工作台上切割成一定长度(如1cm左右)，接种于不定根增殖的液体培养基中，黑暗培养后转入光照培养。优选的，步骤(1)中，乙醇浓度为75％，浸泡叶片30s，转入0.1％升汞浸泡消毒10min，诱导培养基配方为MS+30g·L-1蔗糖+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+6.5g·L-1琼脂。优选的，步骤(2)中，愈伤组织增殖培养基为MS+30g·L-1蔗糖+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+6.5g·L-1琼脂。优选的，步骤(3)中，作为诱导不定根的愈伤组织材料以在步骤(2)的增殖培养上继代增殖5次为宜，不定根诱导培养基为3/4MS+20g·L-1蔗糖+1.0mg·L-1NAA+6.5g·L-1琼脂，培养周期30d，培养温度27±1℃黑暗培养。优选的，步骤(4)中，不定根增殖培养基为1/2MS+30g·L-1蔗糖+2.0mg·L-1IBA+0.8mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+苯丙氨酸60mg·L-1+6.5g·L-1琼脂，培养方式为黑暗培养30d后转入全光照培养15d。本专利技术采用三叶青叶片诱导出愈伤组织、再利用愈伤组织诱导不定根然后进行扩繁，达到不定根的高生物量和黄酮含量。利用本专利技术技术方案不定根的诱导率达到99.0％，平均单个愈伤块分化的不定根数量达到13.77根，平均单个愈伤块分化的不定根质量达到30.70mg，一个培养周期内不定根鲜重增长倍数达到9.35±1.05倍，总黄酮含量经亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定达到69.03±1.39mg·g-1·DW-1。为今后工业化生产三叶青中抗肿瘤功能物质黄酮类化合物奠定了基础，同时可解决三叶青原料的供需矛盾问题。具体实施方式下面对本专利技术优选实施例作详细说明。本实施例三叶青不定根诱导及繁殖方法，其按如下步骤进行：(1)愈伤组织的诱导：将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净，在超净工作台上用乙醇消毒后转入升汞消毒，然后用无菌水冲洗5～6次，切割成0.5cm×0.5cm左右大小，正面朝上平放于诱导培养基上，27±1℃黑暗培养30d。本步骤中，乙醇的浓度为75％，浸泡叶片30s，转入0.1％升汞浸泡消毒10min，诱导培养基配方为MS+30g·L-1蔗糖+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+6.5g·L-1琼脂。(2)愈伤组织的增殖：将步骤(1)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于增殖培养基上，27±1℃黑暗培养30d。本步骤中，愈伤组织增殖培养基为MS+30g·L-1蔗糖+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+6.5g·L-1琼脂。(3)愈伤组织分化不定根的诱导：将步骤(2)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于不定根诱导培养基上，27±1℃黑暗培养30d。本步骤中，作为诱导不定根的愈伤组织材料以在步骤(2)的增殖培养上继代增殖5次为宜，不定根诱导培养基为3/4MS+20g·L-1蔗糖+1.0mg·L-1NAA+6.5g·L-1琼脂，培养周期30d，培养温度27±1℃黑暗培养。(4)不定根的繁殖：将步骤(3)获得的不定根在超净工作台上切割成1cm左右长度，接种于不定根增殖的液体培养基中，黑暗培养后转入光照培养。本步骤中，不定根增殖培养基为1/2MS+30g·L-1蔗糖+2.0mg·L-1IBA+0.8mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+苯丙氨酸60mg·L-1+6.5g·L-1琼脂，培养方式为黑暗培养30d后转入全光照培养15d。本专利技术以三叶青叶片为材料诱导出愈伤组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
三叶青不定根的诱导及繁殖方法，其特征是按如下步骤进行：(1)愈伤组织的诱导：将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净，在超净工作台上用乙醇消毒后转入升汞消毒，然后用无菌水冲洗，后切割，正面朝上平放于诱导培养基上，27±1℃黑暗培养；(2)愈伤组织的增殖：将步骤(1)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于增殖培养基上，27±1℃黑暗培养；(3)愈伤组织分化不定根的诱导：将步骤(2)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种于不定根诱导培养基上，27±1℃黑暗培养；(4)不定根的繁殖：将步骤(3)获得的不定根在超净工作台上切割成设定的长度，接种于不定根增殖的液体培养基中，黑暗培养后转入光照培养。

【技术特征摘要】
1.三叶青不定根的诱导及繁殖方法，其特征是按如下步骤进行：
(1)愈伤组织的诱导：将从三叶青植株上摘取的叶片冲洗干净，在超净工作台上用乙
醇消毒后转入升汞消毒，然后用无菌水冲洗，后切割，正面朝上平放于诱导培养基上，27±1
℃黑暗培养；
(2)愈伤组织的增殖：将步骤(1)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成小块，接种
于增殖培养基上，27±1℃黑暗培养；
(3)愈伤组织分化不定根的诱导：将步骤(2)获得的愈伤组织在超净工作台上切割成
小块，接种于不定根诱导培养基上，27±1℃黑暗培养；
(4)不定根的繁殖：将步骤(3)获得的不定根在超净工作台上切割成设定的长度，接
种于不定根增殖的液体培养基中，黑暗培养后转入光照培养。
2.如权利要求1所述三叶青不定根的诱导及繁殖方法，其特征是：步骤(1)中，乙醇
浓度为75％，浸泡叶片30s，转入0.1％升汞浸泡消毒10min。
3.如权利要求1或2所述三叶青不定根的诱导及繁殖方法，其特征是：步骤(1)中，
诱导培养基配方为MS+30g·L-1蔗糖+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+6.5g·L-1琼脂。
4.如权利要求1所述三叶青不定根的诱导及繁殖方法，其特征是：步骤(2)中，愈伤
组...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱丽华，马华升，姜慧燕，张乐，王贤波，刘洋，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33