诱导多能干细胞、制备诱导多能干细胞的方法技术

本发明专利技术提出了一种诱导多能干细胞及其诱导多能干细胞的制备方法。根据本发明专利技术的实施例，该诱导多能干细胞来源于绒毛细胞。通过本发明专利技术获得的诱导多能干细胞核型正常，具有诱导多能干细胞的多能性特征。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域。具体地，本专利技术涉及一种诱导多能干细胞及其制备方法。
技术介绍
2006年，Yamanaka等人应用重编程技术将小鼠成纤维细胞诱导为多能干细胞，也被称为诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell,iPSC)。诱导多能干细胞是一类能够维持自我更新并具有多潜能分化能力的干细胞。相对于胚胎干细胞，诱导多能干细胞由体细胞直接进入多能干细胞的状态，避免了伦理学争议。另外，研究者得到的诱导多能干细胞可以携带有疾病特异性基因，一方面可建立从疾病基因型到表型的体外细胞模型进行发病机制研究，另外一方面,由于诱导多能干细胞能由疾病个体的细胞获得，在通过分化移植到该个体的过程中因为同源性可避免免疫排斥反应，所以有望应用于临床进行细胞治疗。迄今为止，已经使用来自皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞)、羊水、胚外组织(胎盘和脐带)，脐带血，骨膜，牙组织，脂肪组织，神经干细胞，肝细胞，羊膜来源的间质干细胞和外周血细胞，乳腺上皮细胞，以及在人中由骨外膜和脂肪干细胞，脐带基质和胎盘的供体细胞获得了人诱导多能干细胞。然而，目前的人诱导多能干细胞技术仍有待深入研究。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前的诱导性多能干细胞技术已建立皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞)、羊水、胚外组织(胎盘和脐带)，脐带血，骨膜，牙组织，脂肪组织，神经干细胞，肝细胞，羊膜来源的间质干细胞和外周血细胞，乳腺上皮细胞，以及在人中由骨外膜和脂肪干细胞，脐带基质和胎盘为供体细胞的人iPSCs。但是目前缺乏来自于绒毛细胞的iPSC及制备方法。本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提出了一种绒毛细胞诱导多能干细胞及其制备方法。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种诱导多能干细胞，其来源于绒毛细胞。根据本专利技术的实施例，此绒毛细胞诱导多能干细胞核型正常，具有诱导多能干细胞的多能性特征，包括表达OCT4，SOX2，Nanog，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81多能性标记物以及能够在动物模型体内形成三胚层组织的畸胎瘤。由于原代细胞重编程得到的多能干细胞能进一步诱导分化成滋养细胞,多能干细胞和滋养细胞携带同样的致病基因,可以通过该分化过程对疾病相关的滋养细胞进行体外研究,从而建立体外细胞模型。因此本领域技术人员能够理解根据本专利技术实施例的绒毛细胞诱导多能干细胞可以为产前诊断疾病机制、细胞遗传研究提供细胞疾病模型。关于诱导多能干细胞分化成滋养细胞，可以参见Ezashi,T,Telugu,BPVL,Roberts,RM.Modelsystemsforstudyingtrophoblastdifferentiationfromhumanpluripotentstemcells.CELLANDTISSUERESEARCH,2012,349(3):809-824。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种制备绒毛细胞诱导多能干细胞的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：(1)使多能干细胞诱导因子在绒毛细胞中表达；(2)将步骤(1)中所得到的绒毛细胞在适于去分化的条件下进行培养，以便获得绒毛细胞诱导多能干细胞。通过以上步骤，可以有效地制备绒毛细胞诱导多能干细胞，并且表现出多能干细胞的多能性特征。如前所述，该绒毛细胞诱导多能干细胞核型正常，具有诱导多能干细胞的多能性特征，包括表达Oct4，Sox2，Nanog，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81多能性标记物以及能够在动物模型体内形成三胚层组织的畸胎瘤。根据本专利技术的实施例，上述制备诱导多能干细胞的方法还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，在上述步骤(1)中，所述多能干细胞诱导因子包括OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4以及microRNA302-367。OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4是在胚胎干细胞中能高度表达并决定其“全能性”的四个基因，microRNA302-367具有促进多能干细胞生成的作用。采用第一质粒(携带人OCT4、S0X2、SV40LT、KLF4四个基因)及第二质粒(携带microRNA302-367)将多能干细胞诱导因子转入宿主绒毛细胞，高效表达后促进绒毛细胞向多能干细胞转变并使其具有多能性特征。第一质粒和第二质粒为本领域技术人员常用质粒，优选PEP4作为第一质粒，PCEP4作为第二质粒。换句话说，根据本专利技术的实施例，可以将人OCT4、S0X2、SV40LT、KLF4四个基因构建在同一个质粒，例如PEP4，另外，将microRNA302-367构建在单独的质粒上，例如PCEP4。由此，可以进一步提高获得诱导多能干细胞的效率。根据本专利技术的实施例，在步骤(1)中，优选电转染方式，将携带表达所述多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞中。通过电转，可以高效地将携带表达多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞，促进了绒毛细胞向多能干细胞的转变，从而具有了多能干细胞的多能性特征。根据本专利技术的实施例，在步骤(1)中，电转染条件是200V电压、电击200微秒或300V电压、电击200微秒或200V电压、电击300微秒或300V电压、电击300微秒组合的任一一种，电转染优选200V的电压，电击300微秒。专利技术人发现，通过电转染方式将核酸分子转入绒毛细胞中的效率与电转染的电压和电击时间是非常相关的。通过对各种电转染条件进行筛选，专利技术人意外地发现优选200V的电压，电击300微秒的条件组合。专利技术人发现，如果电压过高或电击时间超过300微秒，则会导致绒毛细胞的死亡率显著增大，如果电压过低或者电击时间低于200微秒，则会导致电转染效率显著下降，无法满足后续形成诱导多能干细胞的需求。优选200V的电压，电击300微秒的电转条件组合，电击两次可以有效提高将携带表达多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞的效率，促进了绒毛细胞向多能干细胞的转变，从而具有了多能干细胞的多能性特征。根据本专利技术的实施例，在步骤(2)中，将所述步骤(1)中所得到的绒毛细胞依次在绒毛细胞培养基和诱导培养基中进行培养。根据本专利技术的实施例，绒毛细胞培养基为CHANGAmnioTM培养基，诱导培养基为mTeSRTM1。根据本专利技术的实施例，该诱导培养基进一步含有终浓度为0.5微摩尔/升的A83-01，终浓度为0.5微摩尔/升的Thiazovivin；终浓度为1微摩尔/升的PD0325901；以及终浓度为3微摩尔/升的CHIR99021。电转后使绒毛细胞在CHANGAmnioTM培养基的环境中进行贴壁和恢复状态，继而在无血清的诱导培养基中进行诱导培养。一方面使得电转后的绒毛细胞恢复状态，贴壁生长，另一方面，无血清培养基可以使得绒毛细胞处于同一细胞周期，同时可以避免血清的干扰。从而有利于绒毛细胞向多能干细胞的转变，使得绒毛细胞诱导多能干细胞具有多能性特征。专利技术人惊奇地发现，当诱导培养基中含有终浓度为0.5微摩尔/升的A83-01，终浓度为0.5微摩尔/升的Thiazovivin；终浓度为1微摩尔/升的PD0325901；以及终浓度为3微摩尔/升的CHIR99021时，可以显著提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导多能干细胞，其来源于绒毛细胞。

【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞，其来源于绒毛细胞。2.一种制备权利要求1所述的诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括：(1)使多能干细胞诱导因子在绒毛细胞中表达；以及(2)将步骤(1)中所得到的绒毛细胞在适于去分化的条件下进行培养，以便获得所述诱导多能干细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述多能干细胞诱导因子包括0CT4、S0X2、SV40LT、KLF4以及microRNA302-367。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，将携带表达所述多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞中，优选地，采用电转染法，将携带表达所述多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞中。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述质粒包括：第一质粒，所述第一质粒携带表达所述0CT4、S0X2、SV40LT和KLF4的核酸分子；以及第二质粒，所述第二质粒携带表达所述micro...

【专利技术属性】
技术研发人员：余艳红，马燕琳，龙平，卫焱星，李崎，
申请(专利权)人：南方医科大学，海南医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：广东;44