用精胺诱导烟草胚状体的方法技术

本发明专利技术公开了一种用精胺诱导烟草胚状体的方法，以精胺作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的胚状体诱导。本发明专利技术以精胺作诱导剂制备的诱导培养基比传统的培养基诱导烟草胚状体形成速度快、产量高、质量好，且原始外植体无需转瓶进行继代培养，即可直接达到生产烟草胚状体的目的。

Method for inducing tobacco embryoid by spermine

The present invention discloses a method for inducing tobacco embryoid with spermine, and an induction medium is prepared by using spermine as inducer to induce embryoid bodies of tobacco leaf explants. The present invention for spermine induction medium than the traditional agent prepared tobacco induced embryoid body formation speed, high yield, good quality, and the original explants without bottle subculture, can directly reach the purpose of embryoid production of tobacco.

【技术实现步骤摘要】
用精胺诱导烟草胚状体的方法
本专利技术涉及植物生物工程组织培养
更具体地说，本专利技术涉及一种用精胺诱导烟草胚状体的方法。
技术介绍
“胚状体”(embryoid)是以体细胞组织或生殖细胞组织材料在特殊培养条件下，没有经过有性的受精过程，却经过了胚胎发育过程，所形成的具有合子胚之生理功能的特殊结构，实际是未来植株的雏形。胚状体亦称体(细胞)胚或无性胚，在生产上可以直接用于制造人工种子和生产再生植株(试管苗)；在理论研究上，是探索细胞分化、器官建成、个体发育，及其相关的解剖学和生理生化变化过程的重要材料。因此，获得胚状体的技术研究是植物生物学界的热门领域之一。烟草胚状体的研究起步相对较晚，国内资料不多，特别是烟草胚状体诱导技术的研究报告更少。具有代表性的有：王瑞库等人【影响烟草花粉胚胎发生的某些因子-铁盐、蔗糖和腺素。黑龙江八一农垦大学学报，1991，(1)：21-27】及【影响烟草花粉胚胎发生的某些因子-氨基酸和激素。黑龙江八一农垦大学学报，1991，(2)：47-52】；司龙亭等人【烟草人工种子研究进展初报。沈阳农业大学学报，1991,22(1)35-40】；贾勇炯等人【在烟草花药培养中诱导胚状体发生的研究。四川大学学报(自然科学版)1996，33(5)：605-608】；潘莉等人。【烟草未授粉子房单倍体诱导及影响因素的研究。河南农业大学学报，1999,33(1)：48-52】；王连华等人【烤烟K326人工种子悬浮培养条件下体细胞胚胎的发生研究。种子，2002，(4)：10-12】；慕平利等人【烟草叶片直接再生-基因转化体系的建立。河南农业科学，2005，(4)：27-29】。现有诱导烟草胚状体的资料虽然分别涉及到MS,H,Nitsch,等不同的基本培养基；不同基因型的栽培品种；不同器官作外植体；固体或液体悬浮，等不同的培养方法。但是，其共同的研究结果主要表现为以下两点：1、适量的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)对烟草胚状体的发生必不可少，增加铁盐、腺素(即腺嘌呤)、KT(激动素)、IAA(吲哚乙酸)和谷氨酰胺等，有利烟草胚状体的发生和发育。由此可见，烟草胚状体的诱导培养基都是由多种诱导剂成分复合配制而成，未见用单一诱导剂成功诱导烟草胚状体的报导。2、现有培养基对烟草胚状体的诱导周期长，效率低。而且原始外植体都要反复转接到新培养基进行继代培养，甚至多达5-6代的培养，长达3-4个月才发生胚状体。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种用精胺诱导烟草胚状体的方法，以精胺作诱导剂制备的诱导培养基比传统的培养基诱导烟草胚状体形成速度快、产量高、质量好，且原始外植体无需转瓶进行继代培养，即可直接达到生产烟草胚状体的目的。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种用精胺诱导烟草胚状体的方法，以精胺作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的胚状体诱导。优选的是，所述的用精胺诱导烟草胚状体的方法，所述诱导培养基为配方为：MS+精胺3.2-4.0mg/L，pH为5.8～6.0。优选的是，所述的用精胺诱导烟草胚状体的方法，所述烟草叶片外植体的获取方法为：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下切成方片，即得烟草叶片外植体，备用。优选的是，所述的用精胺诱导烟草胚状体的方法，将自上至下的第3片叶在无菌条件下切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作烟草叶片外植体。优选的是，所述的用精胺诱导烟草胚状体的方法，将所述烟草叶片外植体接种于灭菌后的诱导培养基中培养20天，获得烟草胚状体。优选的是，所述的用精胺诱导烟草胚状体的方法，所述诱导培养基中精胺的浓度为3.5mg/L。本专利技术至少包括以下有益效果：1)精胺(Spermine,Spm.)，属于植物生长物质多胺类(polyamine)中的一种，是广泛存在于高等植物界的纯天然植物活性物质，对培养材料无毒副作用和残留，本专利技术采用精胺添加于MS配制成单一的诱导培养基，剔除了传统技术认为必不可少，却又有害的物质2,4-D，大大简化培养基的配制程序，节省物力人力，降低了培养成本；2)本专利技术的诱导培养基以精胺作为唯一的诱导剂，针对双子叶植物烟草的特殊生物学特性，在大量筛选试验的基础上，确定了精胺的适宜浓度，使得烟草叶片外植体在诱导培养基作用下进行脱分化形成愈伤组织之后直接再分化，高效优质地形成烟草胚状体，本专利技术的诱导培养基比传统的培养基诱导效果更好，烟草胚状体形成速度快，20d即可发生，胚状体的产量和质量显著提高。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：一种用精胺诱导烟草胚状体的方法，包括以下步骤：步骤一、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，在无菌条件下，将烟草叶片切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；步骤二、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加精胺3.2mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；步骤三、诱导培养：将步骤一获得的烟草外叶片植体接入步骤二的诱导培养基中，培养20天。实施例2：步骤一、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切成方片作为外植体，备用，方片可切成大小约为5mm×5mm；步骤二、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加精胺3.5mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；步骤三、诱导培养：将步骤一获得的烟草叶片外植体接入步骤二的诱导培养基中，培养20天。无菌烟草植株长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，相比其他烟草叶片，作为外植体培养更易发生脱分化、再分化形成胚状体。实施例3：步骤一、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下，切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作为外植体，备用，需要说明的是，前述的沿主脉切片是指弃用了叶片两侧靠边缘的叶片部分，只要主脉两侧的叶片部分；步骤二、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，添加精胺4.0mg/L，调整培养基pH为5.8～6.0，灭菌后备用；步骤三、诱导培养：将步骤一获得的烟草叶片外植体接入步骤二的诱导培养基中，培养20天。无菌烟草植株长至5、6片叶时，自上至下的第3叶为充分成熟健壮的功能叶，细胞代谢旺盛，生命力强，在切除叶片的上下两端以及在沿主脉两边切取5mm×5mm的方片的同时也切除了叶片左右两侧边缘的叶片部分，这种操作有利保证所用的烟草叶片外植体从外部形态到内在代谢水平都更为均匀一致，能有效减少实验结果的材料误差。对比例1：为了说明本专利技术的用精胺诱导烟草胚状体的方法的效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用精胺诱导烟草胚状体的方法，其特征在于，以精胺作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的胚状体诱导。

【技术特征摘要】
1.一种用精胺诱导烟草胚状体的方法，其特征在于，以精胺作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的胚状体诱导。2.如权利要求1所述的用精胺诱导烟草胚状体的方法，其特征在于，所述诱导培养基为配方为：MS+精胺3.2-4.0mg/L，pH为5.8～6.0。3.如权利要求2所述的用精胺诱导烟草胚状体的方法，其特征在于，所述烟草叶片外植体的获取方法为：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下切成方片，即得烟草叶片外植体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周凤珏，龚银花，周文亮，许鸿源，赖洪敏，王五权，韦忠，陈念平，许皓翔，林北森，罗刚，覃迎姿，刘春萍，
申请(专利权)人：广西壮族自治区烟草公司百色市公司，广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45