用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基及培养方法技术

本发明专利技术涉及植物的组织培养领域，旨在提供一种用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基及培养方法。该方法包括：配制四种培养基；在无菌操作条件下，取高丛蓝莓无菌试管苗带叶柄的茎段；进行愈伤组织低温弱光液体浅层培养后，进行蓝莓胚性愈伤组织半凝固培养基低温、黑暗分化增殖培养；蓝莓胚状体固体培养基全光、常温分化成苗培养后，再进行蓝莓生根苗培养。本发明专利技术降低了愈伤组织诱导过程中的非胚性愈伤组织的增殖速度，减少了高温和长期不继代引起的褐变风险。采用的四种细胞分裂素低浓度配合使用，较好的维持了胚性愈伤组织的愈伤组织状态，有利于其在诱导成功后的增殖；生根苗不粘有培养基和其他基质，移栽效率较高，显著降低了人工成本。

Culture medium for indirect regeneration of somatic embryos of high cluster blueberry and culture method

The invention relates to the field of tissue culture of plants, in order to provide a culture medium and a culture method for indirect regeneration of somatic embryos of a high cluster blueberry. The method comprises: preparing four kinds of culture medium; under aseptic conditions, the stems of highbush blueberry sterile plantlets with petiole; callus of low temperature and weak light of shallow liquid culture, blueberry embryogenic callus of semi solidified medium low temperature and dark differentiation culture; embryoid solid culture of blueberry based on all-optical, seedling differentiation after incubation at room temperature, then the rooting culture of blueberry. The invention reduces the proliferation rate of the non embryogenic callus during the induction of callus, and reduces the risk of browning caused by high temperature and long-term non succession. The four kinds of cytokinins in low concentration with the use of better maintenance of embryogenic callus callus, is conducive to the successful induction of proliferation after rooting seedlings; not to stick with medium and other matrix, transplanting efficiency, significantly reduce labor costs.

【技术实现步骤摘要】
用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基及培养方法
本专利技术涉及蓝莓的胚性愈伤组织的高频诱导、增殖及体细胞胚分化成苗方法，属于植物的组织培养领域。
技术介绍
愈伤组织是一团脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构，无明显极性的、松散的细胞团。根据组织学观察、外观特征及其再生性、再生方式等，愈伤组织分成两大类:胚性愈伤组织(embryoniccallus，EC)和非胚性愈伤组织(non-embryoniccallus，NEC，如图1)。一般胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强。胚性愈伤组织又可分为致密型胚性愈伤组织和易碎型胚性愈伤组织(如图4)。胚性愈伤组织具有以下特性：高度的胚性或再分化能力，能再生植株；分散性好，容易散碎，便于建立优良的悬浮系或分离原生质体；旺盛的自我增殖能力，可以制作人工种子作为种苗快繁的新途径；经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作。植物组织培养技术中植物体细胞的再生分为直接再生和间接再生，直接再生一般经由外植体直接诱导胚状体再成苗的方法，胚状体保持时间短，不可以进行继代和增殖，无法进行遗传转化、辐射诱变等操作。间接再生一般经历外植体(或种子、胚)---愈伤组织---胚性愈伤组织---体细胞胚---分化成苗等阶段。间接再生的胚性愈伤组织可进行继代增殖，在合适培养基和继代条件下可一直保持其愈伤组织状态，是进行遗传转化、细胞培养、辐射诱变及制作人工种子等操作必须的试验材料。果树作为木本植物现有技术大多采用胚性预决定的组织(如种子、胚乳、花粉等)诱导胚性愈伤组织的产生，而利用胚性重决定的组织(如叶片、茎段、根等)诱导胚性愈伤组织较难实现，但胚性重决定的组织材料易取得，可选择具有优良品种特性的材料，因此育种上更具有意义。蓝莓果实的保健价值、经济价值在水果中属于佼佼者，其花青苷含量是其他水果的很多倍，因此是一种世界公认的具有很强保健功能的珍贵果品资源。最新资料显示，目前蓝莓已跃居全世界浆果栽培面积和产量第二位，因此发展蓝莓产业具有很高的经济价值和开发前景。我国蓝莓产业化栽培始于本世纪初，现有的品种资源均引自国外，多数品种国内栽培在适应性、丰产性、品质等方面表现较差，开发具有自主知识产权的新品种，对我国蓝莓产业的可持续发展具有重要意义。中国专利申请《一种蓝莓胚状体的诱导方法》(公开号CN103598093A)中公开了一种培养基：WPM为基础培养基，添加吲哚乙酸IAA0.5-1mg、吲哚丁酸IBA0.5～1mg、玉米素ZT0.1～0.5mg、蔗糖30g和琼脂7g，pH为5.2～5.4；。该申请成功之处在于建立了蓝莓茎尖直接诱导胚状体的方法；但不足之处体现在：未经过愈伤组织脱分化成苗的过程，未能获得可增殖的胚性愈伤组织、未有芽生根的培养基配方，因此在分子育种特别是后续的细胞培养和原生质体培养方面无明显的应用价值。崔广荣等“蓝莓离体叶片胚状体高效发生及其组织学观察”(《激光生物学报》，2008第17卷，第5期)同样公开了一种培养基：高灌蓝莓叶片胚状体发生及成苗的培养基为WPM+TDZ0.04mg/L+ZT0.25～2.0mg/L+蔗糖20～40g/L,而培养基WPM+ZT0.5～1.0mg/L+蔗糖20g/L适合于丛芽继代生长。此配方为蓝莓叶片胚状体的直接发生，而非间接再生，如何利用叶片、茎段等胚性重决定外植体诱导可继代增殖的胚性愈伤组织，有利于进一步进行细胞培养、遗传转化等转基因遗传操作，从细胞层面来说具有更加重要的意义。因此，解决蓝莓的胚性愈伤组织高频再生的难题，对蓝莓产业的可持续发展而言具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中蓝莓的胚性愈伤组织高频再生的难题，提供一种用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基及培养方法。为解决技术问题，本专利技术所采取的技术方案为：提供一种用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基，包括用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生中不同培养阶段的下述四种培养基：(1)高丛蓝莓愈伤组织碳饥饿液体诱导培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT0.5-1.0mg/L、TDZ0.1-0.25mg/L、2-ip0.25mg/L和CPPU0.75mg/L，继续添加蔗糖5-10g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；(2)高丛蓝莓胚性愈伤组织诱导及增殖半凝固培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT1mg/L、TDZ0.2mg/L、2-ip0.5mg/L和CPPU1.5mg/L，继续添加蔗糖30g/L，琼脂3-5g/L，调节pH为5.0；(3)高丛蓝莓体细胞胚的成熟分化、成苗再生的有机物培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT1-2.0mg/L和IBA0.1mg/L，继续附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC0.5g/L、琼脂5-7g/L，调节pH为5.0；(4)高丛蓝莓分化苗的生根培养基：在改良1/6MS基本培养基中添加IBA1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC0.5g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；所述ZT、TDZ、2-ip、CPPU、IBA、AC分别指：玉米素、噻苯隆、N6-异戊烯基腺嘌呤、氯吡苯脲、吲哚丁酸、活性炭。所述改良1/2MS基本培养基是对MS培养基的配方进行了调整，其中大量元素减半，微量元素和有机物不变；调整后的具体配方为：大量元素：NH4NO3825mg/L，KNO3950mg/L，CaCl2·2H2O220mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，KH2PO485mg/L；微量元素：KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MnO4·2H2O0.25mg/LCuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；有机成分：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L；所述改良1/6MS基本培养基是对MS培养基的配方中大量元素进行了调整，其中大量元素减至原配方的1/6，微量元素不变，有机物调整为原配方的1/5；具体配方为：大量元素：NH4NO3275mg/L，KNO3317mg/L，CaCl2·2H2O73mg/L，MgSO4·7H2O62mg/L，KH2PO428.3mg/L；微量元素：KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MnO4·2H2O0.25mg/LCuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；有机成分：肌醇20mg/L，烟酸0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.1mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸0.4mg/L。本专利技术进一步提供了前述培养基进行高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养方法，包括下述步骤：(1)按所述配方配制四种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基，其特征在于，包括用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生中不同培养阶段的下述四种培养基：(1)高丛蓝莓愈伤组织碳饥饿液体诱导培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT 0.5‑1.0mg/L、TDZ0.1‑0.25mg/L、2‑ip 0.25mg/L和CPPU 0.75mg/L，继续添加蔗糖5‑10g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；(2)高丛蓝莓胚性愈伤组织诱导及增殖半凝固培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT 1mg/L、TDZ0.2mg/L、2‑ip 0.5mg/L和CPPU 1.5mg/L，继续添加蔗糖30g/L，琼脂3‑5g/L，调节pH为5.0；(3)高丛蓝莓体细胞胚的成熟分化、成苗再生的有机物培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT 1‑2.0mg/L和IBA 0.1mg/L，继续附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC 0.5g/L、琼脂5‑7g/L，调节pH为5.0；(4)高丛蓝莓分化苗的生根培养基：在改良1/6MS基本培养基中添加IBA 1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC 0.5g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；所述改良1/2MS基本培养基具体配方为：大量元素：NH...

【技术特征摘要】
1.一种用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基，其特征在于，包括用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生中不同培养阶段的下述四种培养基：(1)高丛蓝莓愈伤组织碳饥饿液体诱导培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT0.5-1.0mg/L、TDZ0.1-0.25mg/L、2-ip0.25mg/L和CPPU0.75mg/L，继续添加蔗糖5-10g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；(2)高丛蓝莓胚性愈伤组织诱导及增殖半凝固培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT1mg/L、TDZ0.2mg/L、2-ip0.5mg/L和CPPU1.5mg/L，继续添加蔗糖30g/L，琼脂3-5g/L，调节pH为5.0；(3)高丛蓝莓体细胞胚的成熟分化、成苗再生的有机物培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT1-2.0mg/L和IBA0.1mg/L，继续附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC0.5g/L、琼脂5-7g/L，调节pH为5.0；(4)高丛蓝莓分化苗的生根培养基：在改良1/6MS基本培养基中添加IBA1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC0.5g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；所述改良1/2MS基本培养基具体配方为：大量元素：NH4NO3825mg/L，KNO3950mg/L，CaCl2·2H2O220mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，KH2PO485mg/L；微量元素：KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MnO4·2H2O0.25mg/LCuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；有机成分：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L；所述改良1/6MS基本培养基是对MS培养基的配方中大量元素进行了调整，其中大量元素减至原配方的1/6，微量元素不变，有机物调整为原配方的1/5；具体配方为：大量元素：NH4NO3275mg/L，KNO3317mg/L，CaCl2·2H2O73mg/L，MgSO4·7H2O62mg/L，KH2PO428.3mg/L；微量元素：KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MnO4...

【专利技术属性】
技术研发人员：余宏傲，王法格，叶朝军，金微微，康华靖，
申请(专利权)人：温州科技职业学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33