一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，步骤如下选取国槐嫩枝消毒后，取带有腋芽或顶芽的茎段，接入芽启动培养基上，诱导顶芽和腋芽萌发；将诱导出的新梢去掉基部叶片，切成含腋芽或顶芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上，获得无菌试管苗；取无菌试管苗的叶片接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织；将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗；将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进行培养；将培养的丛生芽转入壮苗培养基中，进行壮苗培养后即可炼苗移栽。本发明专利技术方法，再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到95％以上，种苗生长健壮，不但可有效解决优良种苗种质退化问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，属于植物生物

技术介绍
国槐(SophorajaponicaLinn)，别名家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属。国槐为落叶乔木，树势优美，花期较长，极耐修剪，耐寒、耐旱、耐空气污染，又是吉祥、幸福、美好的象征，是理想的行道树种和庭院绿化树种，而且国槐材质优良，花、果实、根皮、树皮可入药，种子可榨油制皂，具有较高的经济价值，应用前景十分广阔。目前，国槐是嫁接龙爪槐、金枝槐、聊红槐、蝴蝶槐等观赏品种的唯一砧木树种，苗木需求大。国槐主要以种子繁殖为主，但其开花结果具有大小年现象，且种子易受病虫害危害，干瘪、空洞现象严重。常规的育种方法，依靠种子或扦插繁殖，难以满足生产的需求，基于此有必要对国槐进行组培快繁研究，提供优质、大量国槐种苗，切实解决国槐苗木需求的瓶颈。国槐古树资源历经千百年的风霜岁月，具有最原始的长寿和抗逆基因，但由于各种原因，衰老死亡的现象时常发生。就古槐衰败的现状来看，常表现为树干腐朽空洞、冠形残缺、顶梢枯萎、枝叶凋零、病虫害严重、根系生长不良等等。这些古槐是大自然和前人留给我们的宝贵的基因资源。近年来，利用生物转基因技术培育具有抗性如抗逆、抗虫、抗病等新型品种是国槐育种的新趋势。到目前为止，对槐树的形成层培养、茎培养、叶片培养、胚培养、未授粉子房的培养均已获得了完整的植株，对原生质的培养也取得了一定的进展。袁秀云等利用国槐的子叶和下胚轴产生了不定芽，王喆之等利用花药培养形成了单倍体植株，HanK.H等(1993，1997)将直径为0.5～1.0cm的枝条消毒后，取出形成层接入愈伤诱导培养基中诱导愈伤，再将愈伤组织转入分化培养基中，获得了丛生芽，将成苗转入生根培养基中，可诱导生根。上述的方法存在的缺点：由于国槐为多年生木本植物，其再生率普遍较低，出芽少，直接影响了国槐的遗传转化。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁育的目的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。目前，有关国槐的体细胞胚诱导技术研究的较少，可以参考的现有技术比较少。国槐为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因型的限制，其他物种的体细胞胚诱导的繁殖技术对国槐没有参考价值。在这一方面，即使是同一物种，不同的品种之间，体胚诱导培养基也不相同。例如，同样是国槐，同一种培养基，对黄金槐适合，对金叶槐就不适合。专利CN102499086A公开了一种刺槐的繁殖方法，以不同胚龄的合子胚为外植体，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+琼脂为胚性愈伤组织的诱导培养基；以MS基本培养基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-苄氨基腺嘌呤+蔗糖+琼脂为体细胞胚诱导培养基，通过对愈伤组织的诱导，形成球形胚后将其转接到MS+水解酪蛋白培养基上，进行体细胞胚的成熟培养，然后转接到MS基本培养基上萌发形成完整小植株。该专利使用刺槐的不同胚龄的合子胚(荚果)作为原料进行体细胞培养，不论是刺槐还是国槐，其每年的花期以及果实期都是固定的两个月左右，所以在进行体细胞培养时具有时间的局限性；国槐的离体叶片、不成熟的合子胚均可诱导产生胚状体。但是，在山东地区，最近几年的国槐小峰危害非常严重，很难采到无虫害的完整种子。其次，相对于国槐叶片诱导来说，不成熟合子胚的诱导时间更长，且诱导出的丛生芽也不如叶片诱导的多。因此，本专利采用取材方便、诱导率高的叶片进行国槐体胚诱导。国槐与刺槐分属不同的属，物种差别较大，不能参考荚果的体细胞培养得到叶片的体细胞培养。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题，提供一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，以解决国槐再生率低下、出芽少的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)将国槐茎消毒后，取带有芽(优选：腋芽或顶芽)的茎段，接入芽启动培养基上，诱导顶芽和腋芽萌发，所述芽启动培养基为：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(2)将诱导出的新梢去掉基部叶片，切成含芽(优选：腋芽或顶芽)的茎段接种在试管苗增殖培养基上培养，获得无菌试管苗，所述试管苗增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/LBA(6-苄基腺嘌呤)+1.0～2.0mg/LIBA(吲哚丁酸)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(3)取无菌试管苗的叶片接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织，所述体胚诱导培养基为：MS+3.0～5.0mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0.5～1.0mg/LBA+0.5～1.0mg/LNAA(萘乙酸)+0.1～0.5mg/LTDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(4)将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗，所述不定芽诱导培养基为：MS+0.1～0.5mg/LBA+0.1～0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(5)将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进行增殖快繁培养；(6)将增殖培养的丛生芽从基部切开，转入壮苗培养基中，进行壮苗培养，所述壮苗培养基为：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(7)将壮苗培养后的小苗切成单株转接到生根培养基上培养后，即可炼苗移栽，所述生根培养基为：1/2MS+0.1～0.5mg/LIBA+0～0.05mg/LNAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0，所述1/2MS是MS全量减半。优选：所述步骤(1)之前还包括选取国槐嫩枝，所述国槐嫩枝为取无病虫害的当年生嫩枝，除去多余的茎叶，用洗洁精仔细清洗后，流水冲洗1小时。优点：减少外植体消毒过程中的污染。优选：步骤(1)中消毒为：于超净工作台上，用体积分数为70％酒精浸泡30～60s，无菌水冲洗2～3次，再用质量分数为0.1％升汞(氯化汞)溶液消毒10～15min，然后用无菌水冲洗4～6次。优选：步骤(3)中无菌试管苗的叶片接种时叶片的处理方法：取无菌试管苗，从茎尖向下第3到第6片展开叶为材料，叶片带短叶柄，用手术刀片垂直于叶片背面主脉划3～4个伤口。优选：上述各步骤中培养条件除特殊说明外，均为培养室温度白天25±2℃，夜晚18±2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，其特征是：包括以下步骤：(1)将国槐茎消毒后，取带有芽的茎段，接入芽启动培养基上，诱导顶芽和腋芽萌发，所述芽启动培养基为：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(2)将诱导出的新梢去掉基部叶片，切成含芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上培养，获得无菌试管苗，所述试管苗增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L BA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(3)取无菌试管苗的叶片接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织，所述体胚诱导培养基为：MS+3.0～5.0mg/L 2，4‑D+0.5～1.0mg/L BA+0.5～1.0mg/L NAA+0.1～0.5mg/LTDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L CH+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(4)将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗，所述不定芽诱导培养基为：MS+0.1～0.5mg/L BA+0.1～0.5mg/L NAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L CH+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(5)将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进行增殖快繁培养；(6)将增殖培养的丛生芽从基部切开，转入壮苗培养基中，进行壮苗培养，所述壮苗培养基为：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(7)将壮苗培养后的小苗切成单株转接到生根培养基上培养后，即可炼苗移栽，所述生根培养基为：1/2MS+0.1～0.5mg/L IBA+0～0.05mg/L NAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0，所述1/2MS是MS全量减半。...

【技术特征摘要】
1.一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)将国槐茎消毒后，取带有芽的茎段，接入芽启动培养基上，诱导顶芽和腋芽萌发，
所述芽启动培养基为：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；
(2)将诱导出的新梢去掉基部叶片，切成含芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上培养，
获得无菌试管苗，所述试管苗增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/LBA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L
琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；
(3)取无菌试管苗的叶片接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织，所述体胚诱导培
养基为：MS+3.0～5.0mg/L2，4-D+0.5～1.0mg/LBA+0.5～1.0mg/LNAA+0.1～0.5mg/L
TDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；
(4)将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗，所述不定芽诱
导培养基为：MS+0.1～0.5mg/LBA+0.1～0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～
1.0mg/LCH+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；
(5)将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进行增殖
快繁培养；
(6)将增殖培养的丛生芽从基部切开，转入壮苗培养基中，进行壮苗培养，所述壮苗培
养基为：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；
(7)将壮苗培养后的小苗切成单株转接到生根培养基上培养后，即可炼苗移栽，所述生
根培养基为：1/2MS+0.1～0.5mg/LIBA+0～0.05mg/LNAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值
5.8～6.0，所述1/2MS是MS全量减半。
2.如权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征是：所述步骤(1)之前还包括选取国槐嫩
枝，所述国槐嫩枝为取无病虫害的当年生嫩枝，除去多余的茎叶，用洗洁精仔细清洗后，流
水冲洗1小时得到。

【专利技术属性】
技术研发人员：李双云，杨国良，李丽，庞彩红，刘盛芳，王守国，张炳孝，夏阳，
申请(专利权)人：山东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37