一种小鼠胚胎细胞及其制备方法和非手术转移方法技术

一种小鼠胚胎细胞及其制备方法和非手术转移方法，属于诱导多能胚胎干细胞领域。本发明专利技术提供的小鼠胚胎的制备方法通过制备、孵育培养供体细胞，细胞融合和胚胎细胞培养和检选等步骤，能通过简单易行的操作方法，快速的诱导并制备出小鼠的胚胎细胞，该胚胎细胞具有较好的全能性和分化能力，能满足各种遗传、发育实验等的需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及诱导多能胚胎干细胞领域，且特别涉及一种小鼠胚胎细胞及其制备方法和非手术转移方法。
技术介绍
小鼠在生物科学研究是一种常用的实验动物。在药物学领域，通常用小鼠胚胎做相关药物的代谢研究，或者相关的疾病的发病机理的研究。然而，小鼠的胚胎的供应却常常不充分，虽然小鼠的生殖能力较强，但是如果从怀孕的小鼠取胚胎；既会有一些伦理方面的问题，通常也会给实验者造成生理或者心理上的不良影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小鼠胚胎的制备方法，该制备方法操作简单，条件温和；能快速方便的诱导制备出小鼠的胚胎细胞。本专利技术的第二目的在于提供一种小鼠胚胎细胞，该小鼠胚胎细胞具备发育的全能性，用途广泛，成本较低。本专利技术的第三目的在于提供一种小鼠胚胎的非手术转移方法，该方法能通过简单的操作，将小鼠胚胎细胞移植到雌性小鼠的子宫内，可以进一步验证胚胎细胞的全能性。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。一种小鼠胚胎的制备方法，包括以下步骤：制备供体细胞步骤：取性成熟的雌性小鼠的表皮细胞和卵细胞；供体细胞孵育步骤：以重编程因子分别与表皮细胞和卵细胞共培养，在-8到-5℃的条件下孵育12-16min；细胞融合步骤：将卵细胞去核得到去核卵细胞，取出表皮细胞的细胞核注入去核卵细胞，并用融合液处理，得到胚胎源细胞；胚胎细胞培养步骤：将胚胎源细胞在含有培养基的培养瓶中培养；胚胎细胞筛选步骤：在超净工作台内，用体视显微镜筛选检查，找到合适的胚胎细胞，将胚胎细胞用胚胎混合液清洗。一种小鼠胚胎细胞，通过上述的小鼠胚胎的制备方法制得。一种小鼠胚胎细胞的非手术转移方法，将上述的小鼠胚胎细胞发育至囊胚期，将囊胚期的小鼠细胞装入移植管，并将移植管放入胚胎移植枪内，清洗并擦干受体雌性小鼠外阴后，将移植枪送入雌性小鼠子宫内，插入移植枪内芯，将小鼠胚胎细胞送入受体雌性小鼠子宫内。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的小鼠胚胎的制备方法通过制备、孵育培养供体细胞，细胞融合和胚胎细胞培养和检选等步骤，该操作方法简单易行，条件简单；通过该方法制备的胚胎细胞，具有较好的全能性和分化能力；将发育至囊胚期的小鼠胚胎细胞的非手术转移方法能进一步验证小鼠胚胎细胞的全能性和分化能力，拓宽小鼠胚胎细胞的应用。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种小鼠胚胎细胞及其制备方法和非手术转移方法作进一步的说明。一种小鼠胚胎的制备方法，包括以下步骤：制备供体细胞步骤：取性成熟的雌性小鼠的表皮细胞和卵细胞；供体细胞孵育步骤：以重编程因子分别与表皮细胞和卵细胞共培养，在-8到-5℃的条件下孵育12-16min；细胞融合步骤：将卵细胞去核得到去核卵细胞，取出表皮细胞的细胞核注入去核卵细胞，并用融合液处理，得到胚胎源细胞；胚胎细胞培养步骤：将胚胎源细胞在培养瓶中培养，将培养瓶放入培养箱中培养。胚胎细胞筛选步骤：在超净工作台内，用体视显微镜筛选检查，找到合适的胚胎细胞，将胚胎细胞用胚胎混合液清洗。在制备供体细胞步骤中，取分化正常的且处于分裂旺盛时期的小鼠的表皮细胞，能最大限度的避免有缺陷的细胞被应用于实验；而选择性成熟的小鼠卵细胞，该卵细胞能适应胚胎发育初期的物质和能量的需求。进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，在供体细胞孵育步骤中，重编程因子包括Oct4、K1f4、c-Myc、Sox2、Lin28或Nanog中的至少一种。细胞核重编过程包括了基因表达模式的改变和表观遗传标记的改变。在体细胞克隆中，卵母细胞首先必须擦除供体细胞核中的分化记忆并建立类似胚胎的全能状态，这个过程需要表观遗传重编(epigeneticreprogramming)以擦除体细胞核中原先的表观遗传模式并在克隆胚胎中建立胚胎的表观遗传特性和基因表达模式。目前的观点认为，表观遗传重编不完善是导致克隆胚胎发育失败、胚胎发育效率较低和表型异常的主要因素。因此，植入前胚胎期的表观遗传重编程对于正确的发育是至关重要的，它能够调节早期胚胎基因表达、细胞分裂进而决定细胞命运。重编程因子在该表观遗传重编过程中发挥重要的作用，重编程因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog。Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因就能将成纤维细胞重编成为胚胎干细胞样细胞。因此，重编程因子目前被研究者用于体细胞克隆技术中，来提高克隆胚胎重编程能力进而提高克隆胚胎发育效率。进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，在供体细胞孵育步骤中，使用的重编程因子的浓度为85ng/μL-90ng/μL。进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，在供体细胞孵育步骤中，重编程因子的浓度为87ng/μL。通过使用浓度为85ng/μL-90ng/μL的重编程因子，以及优选的重编程因子的浓度为87ng/μL，能较好的刺激已分化细胞恢复分化能力。进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，细胞融合步骤中，融合液按每升计包括：0.1-0.12g的BSA、51.0-54.7g的甘露醇、16-24mg的醋酸钙、33-99mg的焦磷酸钾和119.2-178.7mg的Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。在细胞融合液中，细胞能较好的保持其正常的形态，而且细胞的活性也能较好的保持。进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，胚胎细胞融合步骤中，融合液的渗透压为245-252mOsm。调节融合液的渗透压至245-252mOsm(表示1升水中所含的非电解质或电解质的毫摩尔数)，使细胞保持在一个等渗状态下；保持融合液的渗透压的稳定，有利于维持细胞的形态及细胞液的电解质平衡，维持细胞的活力；同时，通过0.22μm的滤膜过滤融合液不仅可以去掉杂质，还能除菌，避免细胞被污染。进一步地，胚胎细胞筛选步骤中，胚胎混合液按每升计，含以下成分：3-5g的氯化钠，0.1-0.3g的氯化钾，1-3g的焦磷酸钾，1-1.5g的磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.05-0.1g的氯化钙，0.1g的氯化镁。加入大量的电解质，可以维持细胞的稳定，维持细胞的活力。进一步地，胚胎细胞筛选步骤中，胚胎混合液按每升计，还含有：3-6ml的牛血清白蛋白溶液或10-100ml的小牛血清；60-85万单位的青霉素，60-85万单位的卡那霉素。加入牛血清蛋白或者小牛血清为细胞提供营养，使细胞得以维持正常的新陈代谢；而加入青霉素或者卡那霉素能有效的抑制细菌的生长，给细胞生长一个安全稳定的环境。一种小鼠胚胎细胞，通过上述的制备方法制得。一种小鼠胚胎细胞的非手术转移方法，将上述的小鼠胚胎细胞发育至囊胚期，将处于囊胚期的小鼠胚胎细胞装入移植管，并将移植管放入胚胎移植枪内，将胚胎移植枪送入受体雌性小鼠的子宫内，插入移植枪内芯，将小鼠胚胎细胞送入受体雌性小鼠的子宫内。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种小鼠胚胎的制备方法，包括以下步骤：制备供体细胞步骤：取性成熟的雌性小鼠的表皮细胞和卵细胞。将取得的性成熟雌性小鼠的表皮细胞和卵细胞加入到细胞培养基中，于温度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠胚胎的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备供体细胞步骤：取性成熟的雌性小鼠的表皮细胞和卵细胞；供体细胞孵育步骤：以重编程因子分别与所述表皮细胞和所述卵细胞共培养，在‑8到‑5℃的条件下孵育12‑16min；细胞融合步骤：将所述卵细胞去核得到去核卵细胞，取出所述表皮细胞的细胞核注入所述去核卵细胞，并用融合液处理，得到胚胎源细胞；胚胎细胞培养步骤：将所述胚胎源细胞在含有培养基的培养瓶中培养；胚胎细胞筛选步骤：在超净工作台内，用体视显微镜筛选检查，找到合适的胚胎细胞，将所述胚胎细胞用胚胎混合液清洗。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠胚胎的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备供体细胞步骤：取性成熟的雌性小鼠的表皮细胞和卵细胞；供体细胞孵育步骤：以重编程因子分别与所述表皮细胞和所述卵细胞共培养，在-8到-5℃的条件下孵育12-16min；细胞融合步骤：将所述卵细胞去核得到去核卵细胞，取出所述表皮细胞的细胞核注入所述去核卵细胞，并用融合液处理，得到胚胎源细胞；胚胎细胞培养步骤：将所述胚胎源细胞在含有培养基的培养瓶中培养；胚胎细胞筛选步骤：在超净工作台内，用体视显微镜筛选检查，找到合适的胚胎细胞，将所述胚胎细胞用胚胎混合液清洗。2.根据权利要求1所述的小鼠胚胎的制备方法，其特征在于，所述供体细胞孵育步骤中，所述重编程因子包括Oct4、K1f4、c-Myc、Sox2、Lin28或Nanog中的至少一种。3.根据权利要求1-2任一项所述的小鼠胚胎的制备方法，其特征在于，所述供体细胞孵育步骤中，所述重编程因子的浓度为85ng/μL-90ng/μL。4.根据权利要求3所述的小鼠胚胎的制备方法，其特征在于，所述供体细胞孵育步骤中，所述重编程因子的浓度为87ng/μL。5.根据权利要求1所述的小鼠胚胎的制备方法，其特征在于，所述细胞融合步骤中，所述融合液按每升计包括：0.1-0.12g的BSA...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡军利，
申请(专利权)人：青岛松良基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37